Experimenteer om een ​​bacteriofaag te cultiveren en op te sommen

Experimenteer om een ​​bacteriofaag te cultiveren en op te sommen!

Beginsel:

Een suspensie van bacteriën, gevoelig voor een bacteriofaag (virus dat bacteriën infecteert) wordt gezaaid met die bacteriofaag en kan groeien als een confluent gazon op een agarplaat.

De bacteriofaagdeeltjes groeien in de bacteriecellen en lyseren ze. Lysis van de bacteriecellen resulteert in de vorming van heldere zones in het samenvloeiende gazon van bacteriën. Deze vrije zones worden 'plaques' genoemd. Van elke vrije zone wordt aangenomen dat deze wordt gevormd door een enkel bacteriofaagdeeltje. Het aantal plaque-vormende eenheden (PFU's) vertegenwoordigt dus het aantal van de bacteriofaag.

Seriële verdunningstechniek wordt gebruikt in de opsomming van bacteriofagen die vergelijkbaar zijn met die gebruikt in de telling van bacteriën. Het aantal faagdeeltjes aanwezig in een monster wordt bepaald door het aantal op de geënte agarplaat gevormde plaques te tellen en dit te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor.

Om een ​​geldig faaggetal te bepalen, mag het aantal plaques per plaat niet groter zijn dan 300 noch minder zijn dan 30. Platen met meer dan 300 PFU's worden 'te veel om te tellen' (TNTC) genoemd, terwijl platen met minder dan 30 PFU's worden genoemd 'te weinig om te tellen' (TFTC).

Vereiste materialen:

Trypton bouillon, trypton zachte agar, trypton op harde agar, erlenmeyer, reageerbuizen, gesteriliseerde petrischalen, wattenstoppen, bouilloncultuur van bacteriofaag (Ex: T 2 coliphage), voedingsbodemcultuur van de bacteriën (Ex: Escherichia coli B), gesteriliseerde pipetten, autoclaaf, warmwaterbad, bunsenbrander, laminaire stromingskamer, wegwerppot, incubator.

Procedure:

1. Vijftien pipetten (in een roestvrijstalen pipetkoker) en vijf petrischalen worden gesteriliseerd in een heteluchtoven bij 180 ° C gedurende 3 uur. Als alternatief kunnen ze worden afgedekt met handgeschept papier, verbonden met draad of rubberen band en gesteriliseerd in een autoclaaf samen met de media (figuur 8.3).

2. De ingrediënten van tryptonbouillonmedium of het kant-en-klare poeder ervan, benodigd voor 100 ml bouillon, worden gewogen en opgelost in 100 ml gedestilleerd water in een erlenmeyer van 250 ml door schudden en zwenken. De pH wordt naar behoefte aangepast met behulp van 0, 1 N HC1 of 0, 1 N NaOH. De kolf wordt, indien nodig, verwarmd om de ingrediënten volledig op te lossen.

3. De bouillon wordt verdeeld in 10 reageerbuizen (elk 9 ml), met katoen bedekt, bedekt met ambachtelijk papier en met draad of rubberen band gebonden.

4. De ingrediënten van het trypton-zachte agarmedium of het kant-en-klare poeder ervan, vereist voor 100 ml medium, worden gewogen en opgelost in 100 ml gedestilleerd water in een erlenmeyer van 250 ml door schudden en zwenken. De pH wordt naar behoefte aangepast met behulp van 0, 1 N HC1 of 0, 1 N NaOH. De kolf wordt verwarmd om de agar volledig in het medium op te lossen.

5. Dit vloeibare medium wordt verdeeld in 5 reageerbuizen (elk 2 ml), met katoen bedekt, bedekt met ambachtelijk papier en met draad of rubberen band verbonden.

6. De ingrediënten van trypton hard agarmedium of het kant-en-klare poeder dat vereist is voor 100 ml medium worden afgewogen en opgelost in 100 ml gedestilleerd water in een erlenmeyer van 250 ml door verwarming na pH-bijstelling tot 7, 5. De fles is van katoen, verstopt, bedekt met handgeschept papier en vastgemaakt met draad of rubberen band.

7. De 10 trypton bouillonbuizen, de 5 trypton zachte agarbuizen en de kolf die trypton hard agarmedium bevat worden gesteriliseerd bij 121 ° C (15 psi druk) gedurende 15 minuten in een autoclaaf.

8. Het gesteriliseerde trypton harde agarmedium in de erlenmeyer wordt aseptisch in 5 gesteriliseerde petrischalen gegoten om 5 trypton-harde agarplaten te krijgen.

9. Eén ml van de voorraadkweek van de bacteriofaag (Ex: T 2- colifaag) wordt aseptisch overgebracht, bij voorkeur in een laminaire stroomkamer, naar een trypton bouillonbuis (9 ml) met behulp van een gesteriliseerde pipet. Dit wordt de 10-voudige verdunning (dwz 10 -1 ). Dit wordt aseptisch serieel verdund in de andere negen bouillonbuizen om een ​​uiteindelijke verdunning van 10-10 te krijgen (Figuur 8.4).

10. De 5 gesteriliseerde trypton zachte agar-buizen worden op een waterbad tot 100 ° C genomen en verwarmd om de agar te smelten. De buizen worden gekoeld en de gesmolten zachte zachte buizen worden op 45 ° C gehouden.

11. Uit de bovengenoemde 10 buizen die fagen in verschillende concentraties bevatten, zijn vijf buizen (dat wil zeggen 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 en 10-9 ) geselecteerd. Van deze buizen wordt aseptisch elk 1 ml overgebracht naar de vijf trypton-zachte agarbuizen met behulp van afzonderlijke gesteriliseerde pipetten.

12. Twee druppels voedingsbodemcultuur van de bacteriën (Ex: Escherichia coli B) wordt aseptisch overgebracht, bij voorkeur in een laminaire stromingskamer, naar elke trypton zachte agarbuis die de bacteriofaag in vijf verschillende concentraties bevat ( 10-5 tot 10-9). ).

13. De inhoud van de vijf trypton-zachte agarbuizen die de bacteriofaag en de bacteriën bevatten, wordt snel gemengd door te roteren tussen de handpalmen.

14. De inhoud wordt aseptisch gegoten over de vijf trypton-harde agarplaten gemerkt met 10-5 tot 10-9, waardoor een dubbellaagse plaatcultuurbereiding wordt gevormd. De platen worden zachtjes gewerveld en kunnen uitharden.

15. De platen worden geïncubeerd in omgekeerde positie bij 37 ° C in een incubator.

opmerkingen:

1. Alle platen worden geobserveerd voor plaquevormende eenheden (PFU's) die zich ontwikkelen als heldere zones op het gazon van bacteriën.

2. Alleen die platen met PFU's tussen 30 en 300 worden beschouwd voor het tellen van de faag. Het aantal PFU's op elke plaat wordt geteld. Platen met meer dan 300 PFU's worden aangeduid als 'te veel om te tellen' (TNTC), terwijl platen met minder dan 30 PFU's worden aangeduid als 'te weinig om te tellen' (TFTC). Dergelijke platen worden niet beschouwd.

3. Op basis van de waarnemingen wordt het aantal bacteriofagen per ml van de voorraad faagkweek berekend met behulp van de volgende formule.

Aantal fagen / ml = aantal PFU's X verdunningsfactor

Als het aantal PFU's bijvoorbeeld 280 is in een verdunning van 10-7, dan is het aantal fagen in de stamcel van faag 280 x 107 faag / ml (= 2, 80 x 109 faag / ml).