Transgene dieren: doelstellingen van genoverdracht met verschillende transfectiemethoden
Transgene dieren: doelstellingen van genoverdracht met verschillende transfectiemethoden!
Een transgeen dier bevat in zijn genoom een gen of genen geïntroduceerd door een of de andere techniek van transfectie.
Het gen geïntroduceerd door transfectie wordt een transgen genoemd. In dieren specificeert transfectie de introductie van een DNA-segment, hetzij naakt of geïntegreerd in een vector, in een dierlijke cel.
Doelstellingen van Gene Transfer:
1. Genetische modificatie van dieren kan gericht zijn op het verbeteren van hun melk, vlees, wol, enz. Productie.
2. Genen zijn overgebracht in dieren om een grootschalige productie van de eiwitten gecodeerd door deze genen in de melk, urine of bloed van dergelijke dieren te verkrijgen.
3. Een speciaal geval van genoverdracht is gericht op het verlichten of zelfs elimineren van de symptomen en daaruit voortvloeiende ellende van genetische ziekten. In deze benadering worden normale en functionele kopieën van het defecte gen in de patiënt geïntroduceerd (gentherapie).
4. Specifieke transgene diersoorten of -lijnen worden gecreëerd om te voldoen aan gespecialiseerde experimentele en / of biomedische behoeften.
Transfectiemethoden:
Er zijn verschillende benaderingen gebruikt voor de introductie van DNA in dierlijke cellen / embryo's die als volgt zijn:
(i) Calciumfosfaatprecipitatie.
(ii) Directe micro-injectie.
(iii) Retrovirus-infectie.
(iv) Lipofectie.
(v) Deeltjespistoolafgifte en
(vi) Electropoiation.
Calciumfosfaat neerslag:
In deze benadering wordt het DNA-preparaat dat moet worden gebruikt voor transfectie eerst opgelost in een fosfaatbuffer. Calciumchlorideoplossing wordt vervolgens aan de DNA-oplossing toegevoegd; dit leidt tot de vorming van onoplosbaar calciumfosfaat dat co-precipiteert met het DNA. Het calciumfosfaat-DNA-precipitaat wordt toegevoegd aan de te transfecteren cellen.
De geprecipiteerde deeltjes worden door de cellen opgenomen door fagocytose. Aanvankelijk werd 1-2% van de cellen getransfecteerd door deze benadering. Maar de procedure is nu aangepast om transfectie van tot 20% van de cellen te verkrijgen. In een klein deel van de getransfecteerde cellen wordt het DNA geïntegreerd in het celgenoom, waarbij een stabiele of permanente transfectie wordt geproduceerd.
Deze algemene benadering kan worden toegepast op vrijwel alle zoogdiercellen en een zeer groot aantal cellen kan met weinig inspanning worden behandeld. Maar veel cellijnen houden niet van het calciumfosfaat neerslag dat hecht aan hun oppervlakken of hun substraat.
lipofectie:
De aflevering van DNA in cellen met behulp van liposomen wordt lipofectie genoemd. Liposomen zijn kleine vesicles bereid uit een geschikt lipide. Aanvankelijk werden niet-ionische lipiden gebruikt voor het bereiden van liposomen zodat DNA moest worden geïntroduceerd in de vesicles na specifieke inkapselingsprocedures.
Het gebruik van kationische lipiden voor de constructie van liposomen is een duidelijk voordeel aangezien DNA spontaan en efficiënt complexeert met deze liposomen waardoor inkapselingsprocedures onnodig zijn. De kationische liposomen hebben een enkel lipide dubbellaag membraan (unilamellair) en ze binden efficiënt aan de cellen. Waarschijnlijk fuseren ze met het plasmamembraan en bezorgen ze daarmee het DNA (gecomplexeerd met hen) in de cellen, wat leidt tot transfectie.
Lipofectie is de voorkeursmethode voor transfectie van zoogdiercellen in vitro. Het is ook gebruikt om DNA in levende dieren af te leveren door directe injectie of intraveneuze injectie. Kationische liposomen zijn gebruikt in intraveneuze of intratracheale injectie in muizen voor de expressie van markergenen in longen. Gerichte aflevering is ook aangetoond door het opnemen van specifieke ligand-eiwitten in de liposoommembranen.
Retrovirale infectie:
Recombinante retrovirussen produceren virionen, die worden gebruikt voor het infecteren van dierlijke cellen en embryo's van muizen. Het recombinante retrovirus-RNA-genoom wordt gekopieerd door reverse transcriptase om een DNA-kopie op te leveren (omzettranscriptie), die wordt geïntegreerd in het genoom van de cel. De reverse transcriptase wordt gecodeerd door het retrovirus en wordt onmiddellijk na infectie geproduceerd.
De reverse transcriptie kan echter alleen voorkomen in die cellen, die door de S-fase gaan, dat wil zeggen mitotisch actief zijn. De DNA-kopie van het recombinante retrovirus integreert op willekeurige plaatsen in het cellulaire genoom en gaat gewoonlijk niet gepaard met deleties of herschikkingen.
Micro-injectie:
Bij deze methode wordt de DNA-oplossing direct in de kern van een cel of in de mannelijke pronucleus van een bevruchte eicel met twee cellen geïnjecteerd. Typisch bestaat een micro-injectiesamenstel uit een stereoscopische ontleedmicroscoop met een laag vermogen (om de eicel en het gehele proces te bekijken) en twee micromanipulators, één voor een glazen micropipet om de eicel vast te houden door gedeeltelijke zuiging en de andere voor een glazen injectienaald om de DNA in de mannelijke pronucleus. De mannelijke pronucleus is veel groter dan de vrouwelijke pronucleus van bevruchte eicellen van zoogdieren. In visseneieren wordt het DNA echter in het ei-cytoplasma geïnjecteerd.
De algemene procedure voor micro-injectie is als volgt: donordiertjes worden geïnduceerd tot superovulatie met behulp van geschikte hormoonbehandelingen. De superovuleerde vrouwtjes worden vervolgens gepaard met vruchtbare mannen en grote aantallen bevruchte eicellen / embryo's van één of twee cellen worden chirurgisch verzameld. Als alternatief worden onbevruchte eicellen verzameld bij super-ovulated vrouwtjes; de eicellen worden vervolgens in vitro bevrucht. Het transgenconstruct wordt bereid in een bufferoplossing en wordt geïnjecteerd in de mannelijke pronuctei van bevruchte eieren met behulp van een micro-injectiesamenstel.
