Essay on Cloning Vectors, Genomic and cDNA Library

Lees dit essay om te leren over kloneringsvectoren, genomische en cDNA-bibliotheek. Na het lezen van dit essay zul je leren over: 1. Betekenis van klonen Vector 2. Kenmerken van een kloneringsvector 3. Soorten vectoren 4. DNA-bibliotheek 5. cDNA-bibliotheek.

Inhoud:

Essay over de betekenis van klonen Vector
Essay over de kenmerken van een klonenvector
Essay over de soorten vectoren
Essay over de DNA-bibliotheek
Essay over de cDNA-bibliotheek

Essay # 1. Betekenis van klonen Vector:

Een kloneringsvector kan ook worden aangeduid als een kloneringsvehikel of drager-DNA of eenvoudigweg als een vector of een vehikel. De kloneringsvector is het DNA-molecuul waarin het doel-DNA wordt geïntroduceerd voor klonering en dat in staat is tot replicatie in gastheerorganisme. Deze vectoren kunnen plasmiden, bacteriofagen, cosmiden, virussen, etc. zijn.

Essay # 2. Kenmerken van een kloonvector:

Een kloonvector moet enkele belangrijke kenmerken hebben die als volgt zijn:

1. Het moet in het gastheerorganisme na zijn introductie kunnen repliceren om meerdere kopieën van doel-DNA samen met zichzelf te produceren.

2. Het moet gemakkelijk te bereiden zijn, dwz het moet gemakkelijk geïsoleerd en gezuiverd kunnen worden.

3. Het moet kleiner zijn om problemen tijdens het klonen van genen te voorkomen.

4. Het moet markergenen bevatten (zoals tet ^r, kan ^r, enz.) Die helpen bij de selectie van getransformeerde cellen van de niet-getransformeerde cellen.

5. Er moet een unieke splitsingsplaats aanwezig zijn voor restrictie-enzymen.

6. Een vector moet specifieke controlesystemen bevatten zoals promoters, terminators, operatoren, enz. Zodat het gekloneerde DNA correct kan worden uitgedrukt.

Essay # 3. Soorten vectoren:

Er zijn een aantal verschillende vectoren die kunnen worden gebruikt om het gewenste DNA-fragment in een geschikte gastheer te kloneren. Twee brede categorieën van vectormoleculen worden gebruikt, namelijk plasmiden en bacteriofagen. Er zijn echter ook enkele andere typen vectoren ontwikkeld, zoals cosmiden, fagemiden. plantenvirus, etc.

Een kort overzicht van de verschillende kloningsvectoren wordt hieronder gegeven:

(1) Plasmid-vectoren:

Plasmiden zijn de extra chromosomale dubbelstrengige, gesloten en circulaire, zichzelf replicerende DNA-moleculen die in de bacteriecellen aanwezig zijn. Hun grootte varieert van 1 kb tot meer dan 200 kb. Plasmiden kunnen onafhankelijk bestaan of kunnen in het bacteriële chromosoom worden geïntegreerd.

Die plasmiden die in het bacteriële chromosoom zijn geïntegreerd, worden als episomen genoemd. Een aantal eigenschappen van de gastheer worden verleend door de plasmiden zoals stikstoffixatie, resistentie tegen antibiotica, productie van antibiotica, productie van colicinen, enz.

Een paar meest bestudeerde typen bacteriële plasmiden zijn:

ik. R-plasmide: ze dragen genen voor resistentie tegen antibiotica.

ii. F-plasmide of vruchtbaarheidsfactor: verantwoordelijk voor conjugatie.

iii. Col-plasmiden: draag genen voor colicinen (het eiwit dat gevoelige E.coli-cellen doodt).

iv. Ti-plasmiden (Tumor inducerend) en Ri-plasmiden (wortel inducerend) van Agrobacterium spp.

Plasma's met enkele kopie en meerdere kopieën:

Wanneer de plasmiden worden gehandhaafd als slechts één kopie per bacteriële cel, worden ze als plasmaten met enkelvoudige kopie genoemd. Daarentegen worden de meervoudige kopie of multi-kopie plasmiden gewoonlijk gehandhaafd als 10-20 kopieën per bacteriële cel (figuur 1).

Ontspannen en stringente replicatie van plasmiden:

De multi-kopie plasmiden repliceren onder de ontspannen replicatiecontrole waar ze meer dan één replicatie ondergaan voor elke replicatie van hun gastheergenoom (figuur 2).

Aan de andere kant is de replicatiecontrole van de single-copy plasmiden hetzelfde als die van het gastheergenoom. Dit betekent dat de plasmaten met enkelvoudige kopie slechts één replicatie ondergaan voor elke replicatie van hun gastheergenoom en dit wordt de stringente replicatiecontrole genoemd.

Om bruikbaar te zijn als een kloneringsvector, moet het plasmide de eigenschappen van een goede vector zoals kleinere grootte, merkergenen, unieke splitsingsplaatsen dragen en zou het in staat moeten zijn om op een ontspannen wijze te repliceren.

Wanneer de plasmiden worden gerepliceerd onder ontspannen replicatiecontrole, worden ze in zeer groot aantal kopieën in de cel verzameld, kunnen 1000 kopieën per cel of meer zijn. In dit geval wordt dus de opbrengstpotentiaal verhoogd; daarom worden dergelijke plasmiden (dwz multi-kopie plasmiden) gebruikt als kloneringsvectoren.

Sommige plasmiden kunnen, vanwege de specificiteit van hun oorsprong van replicatie, repliceren in slechts één soort van gastheercel. Andere plasmiden hebben minder specifieke oorsprong van replicatie en kunnen repliceren in een aantal bacteriesoorten. Deze plasmiden worden respectievelijk als smal-gastheerbereik en breed-gastheerbereik-plasmiden genoemd.

Als autonome, zelfreplicerende genetische elementen hebben plasmiden de basisattributen om ze mogelijke kloneringsvectoren te maken. De in de natuur voorkomende plasmiden kunnen echter verschillende belangrijke kenmerken missen die vereist zijn voor een kloneringsvector van hoge kwaliteit.

Daarom kan het nodig zijn om de natuurlijke plasmiden door genetische manipulatie te modificeren om de geschikte kloneringsvectoren te verkrijgen waarnaar wordt verwezen als de gemodificeerde of gemanipuleerde plasmidevectoren.

Deze modificaties kunnen worden gedaan door genen in te voegen voor antibioticumresistentie of voor relaxte replicatie, enz., In het plasmide. Een aantal van dergelijke gemodificeerde plasmiden is verkregen die wonderen verrichten als kloneringsvectoren.

pBR322:

Het is een veelgebruikt, populair plasmide voor moleculair klonen. In de naam ervan geeft p het aan als een plasmide; BR staat voor namen van onderzoekers F. Bolivar en R. Rodriguez die dit plasmide hebben gemaakt, terwijl 322 de numerieke aanduiding is die door zijn makers aan dit plasmide is gegeven. Het is in het laboratorium van natuurlijke plasmiden gemaakt zodat het de gewenste eigenschappen van een klonering zou bezitten vector.

De bruikbare kenmerken van pBR322 zijn de kleinere omvang (~ 4, 4 kb) en de aanwezigheid van twee antibioticaresistentiegenen die resistentie tegen ampicilline (amp ^r ) en tetracycline (tet ^r ) verlenen. Een ander voordelig kenmerk van pBR322 is dat het in E. coli op een hoog kopie-aantal wordt gehouden, maar het heeft een oorsprong van DNA-replicatie die alleen in E. coli functioneert en daarom niet gemakkelijk kan worden overgedragen aan andere bacteriën.

pBR327:

Het is afgeleid van pBR322 na het maken van enkele wijzigingen, zoals verwijdering van ~ 1 1 kb segment. In tegenstelling tot pBR322 is het een niet-conjugatief plasmide en daarom richt het zijn eigen overdracht niet naar andere E.coli-cellen. Het kan worden gehandhaafd in een groter aantal kopieën (45 - 60) per cel van E. coli in vergelijking met dat van pBR322.

pUC8:

Deze gemodificeerde plasmidevector is afgeleid van pBR322. Het bevat het lacZ-gen en ampicillineresistent gen (amp ^r ). Een van de belangrijkste voordelen van het gebruik van dit plasmide als vector is dat de recombinante cellen in een enkelstapsproces kunnen worden geïdentificeerd. Daarom neemt het kloneringsexperiment met pUC8 bijna de helft van de tijd in beslag vergeleken met dat met PBR322 of pBR327.

PUC19:

Dit is ontwikkeld vanuit pBR322. De grootte is ~ 2, 7 kb. Het bevat een ampicillineresistent gen (amp ^r ), lac Z'-gen, met vele unieke kloneringsplaatsen) en een replicatieoorsprong van pBR322.

(2) Bacteriofaagvectoren:

Bacteriofagen zijn de virussen die bacteriën infecteren. Deze zijn algemeen bekend als fagen. Bacteriofagen vallen de bacteriële cellen aan en injecteren genetisch materiaal (DNA of RNA) erin, dat vervolgens wordt gerepliceerd en tot expressie wordt gebracht in de bacterie. Twee bacteriofagen die zijn gemodificeerd en die gewoonlijk worden gebruikt als kloneringsvectoren zijn Phage-A en Phage-M 13.

Phage lambda (λ) Vector:

Het bevat ~ 48 kb DNA dat lineair en dubbelstrengs is met enkelstrengige complementaire uiteinden van 12 nucleotiden (die worden aangeduid als cohesieve uiteinden). Phage- λ. genoom heeft een groot niet-essentieel gebied dat niet belangrijk is voor cellysis. In dit A-genoom kan het vreemde DNA worden ingebracht of kan het faag-DNA worden vervangen door het vreemde DNA.

Na infectie treedt dit lineaire A-genoom met vreemd DNA de bacteriële cel binnen. In de bacteriecel circuleert dit λ-genoom door het paren van cohesieve uiteinden. Dergelijke verzegelde samenhangende uiteinden worden nu cos-sites genoemd (figuur 4). Nu kan de faag lytische of lysogene fase aannemen en produceert een aantal van zijn kopieën.

Phage M13 Vector:

Het is een zeer kleine faag van E. coli die alleen via sex-pilus infecteert. Het DNA is cirkelvormig, enkelstrengs en is - 10 kb lang. Na binnengaan in de E. coli-cel, synthetiseert dit enkelstrengs DNA de complementaire streng en wordt zo dubbelstrengs, wat een tussenvorm is die bekend staat als replicatieve vorm (RF).

In deze RF wordt de oorspronkelijke streng weergegeven als '+' en wordt de nieuwe streng weergegeven als streng. Alleen de '+' - streng is verpakt in de nieuwe faagcoats. Deze RF van faag M13 werkt als een plasmide en wordt gebruikt als een vector voor klonering (figuur 5).

(3) Cosmid Vectors:

Cosmid is een kloneringsvector die bestaat uit de kostenplaats van faag-X ingevoegd in een plasmide. De term cosmide is afgeleid van 'cos' en 'plasmid' . Kosmiden missen de genen die coderen voor virale eiwitten. Deze worden normaal gesproken gebruikt voor het kloneren van DNA-fragmenten tot 45 kb lang.

Typische cosmiden hebben de volgende kenmerken:

een. Een oorsprong van replicatie

b. Unieke restrictiesite

c. Een markergen van plasmide.

d. Een 'cos' -site van ongeveer 12 basen lang.

e. De grootte is klein.

De cos-site die aanwezig is in het cosmide helpt het genoom voor circularisatie en ligatie. Voorbeelden van cosmidevectoren zijn c2XB, sCos-series, enz. (Fig. 6).

(4) Phagemid Vector:

Een faagmide wordt beschreven als een dubbelstrengs plasmidevector die een oorsprong van replicatie van een filamenteuze faag bevat, naast die van het plasmide. Het kan worden gebruikt om een enkelstrengige versie van een gekloneerd gen te synthetiseren.

Een voorbeeld van een fagemidevector is pBlueScriptllKS (+/-) (figuur 7). Het is een fagemidevector die ~ 2960 bp lange afgeleide van pUC19 is. De letters KS in zijn naam stellen voor dat de transcriptie van lacZ-gen beweegt van de restrictieplaats Kpnl naar Sacl.

Belangrijke kenmerken in de vector pBlueScript HKS (+/-) zijn:

1. Een oorsprong van replicatie van faag f1.

2. Een lac-promotor die complementeert met lacZ-gen.

3. Meervoudige kloneringssites (MCS) geflankeerd door faag T3- en T7-promotersequenties in tegengestelde richtingen op de twee strengen.

4. Ampicilline Resistentiegen (ampr) is ook aanwezig.

5. Een oorsprong van replicatie ColEl ori van een plasmide.

(5) Kunstmatige chromosoomvectoren:

Kunstmatige chromosomen zijn eigenlijk de kleine en goed gedefinieerde DNA-sequentie die is geconstrueerd als recombinant chromosoom. Deze kunstmatige chromosomen kunnen worden gebruikt als vectoren voor het dragen van zeer grote gekloonde fragmenten van DNA.

Verschillende soorten kunstmatige chromosoomvectoren zijn:

YAC:

Gist Kunstmatig Chromosoom. YAC is een lineaire vector die zich gedraagt als gistchromosoom.

Een typische YAC bestaat uit:

(a) Een centromeer element (CEN)

(b) Een autonoom replicerende sequentie (ARS), dat wil zeggen een oorsprong van replicatie voor gist.

(d) Selecteerbare merkergenen voor gist.

Een bekend voorbeeld van YAC is pYAC3 en de organisatie ervan wordt getoond in de gegeven afbeelding. 8.

BAC's worden gebruikt als een alternatief voor de YAC-kloneringsvector. Deze worden stabiel gehouden in E. coli als een grote enkele kopie. Ze zijn geconstrueerd met behulp van de F-factor (vruchtbaarheidsfactor) die aanwezig is in E.coli. BAC's zijn geschikt voor het kloneren van zelfs grote (~ 50 kb of meer) DNA-sequenties. Voorbeelden van BAC-vectoren zijn pBAC108L, pBeloBACl11, enz.

Andere soorten kunstmatige chromosomen zijn:

MAC: Mammalian Artificial Chromosomes

HAC: Human Artificial Chromosomes.

(6) Op plantenvirus gebaseerde vector:

Plantenvirussen veroorzaken infecties die resulteren in de introductie van hun genen in gastheercellen. Het DNA-insert gekoppeld aan viraal DNA kan ook in de gastheercellen worden afgeleverd en dus planten-virussen functioneren ook als kloneringsvectoren. Enkele voorbeelden van dergelijke planten-virussen zijn caulimovirus, Gemini-virus, tobamovirus, etc.

(7) Op dierenvirus gebaseerde vectoren:

Er zijn een aantal virussen in de natuur die ziekten bij dieren veroorzaken. Het vermogen van dierlijke virussen om hun genetisch materiaal in de gastheercel te injecteren, wordt benut om de kloneringsvectoren op basis van dierlijk virus te ontwerpen. Voorbeelden zijn adenovirus, retrovirus, baculovirus, etc.

(8) Shuttle-vectoren:

Deze vectoren worden gecreëerd door recombinante technieken. Ze hebben het vermogen om zich te vermenigvuldigen in de cellen van meer dan één organisme. Ze kunnen zowel in eukaryotische als in prokaryotische cellen voorkomen. Ze hebben twee oorsprongen van replicatie, één specifiek voor elk gastheerorganisme.

Belangrijke eigenschappen van shuttle-vectoren worden hieronder gegeven:

een. Het is in veel organismen te repliceren.

b. Het is klein van formaat.

c. Selecteerbare markeringen zijn aanwezig om de vector eenvoudig te herkennen.

d. Het is stabiel.

e. Het is niet-pathogeen.

Een belangrijk voorbeeld van shuttle-vectoren is YEp (Yeast Episomal Plasmid) dat in Ecoli en gist kan repliceren.

(9) Transposons of transponeerbare elementen kunnen ook worden gebruikt als kloneringsvectoren.

Expression Vector:

Het is een vector die op een zodanige manier is ontworpen dat het DNA-insert geïntegreerd met vector tot expressie wordt gebracht in het gastheerorganisme. Eenvoudige kloneringsvectoren resulteren alleen in de opname van het vreemde gen in de gastheercel. Maar als het gaat om het bereiken van de productie van recombinante eiwitten die worden gecodeerd door dit vreemde gen, moet deze kloneringsvector worden gewijzigd, hetgeen wordt gedaan door enkele speciale sequenties in te voegen.

Een dergelijke gemodificeerde kloneringsvector die is ontworpen voor de expressie van vreemd gen (of DNA-insert) in de gastheercellen wordt Expressievector genoemd.

Men moet hier weten dat de speciale sequenties die voor een dergelijke modificatie worden gebruikt de promotersequentie zijn (verschaft signalen voor het starten van de transcriptie) en terminatorsequentie (verschaft signalen voor het beëindigen van de transcriptie). In eenvoudige woorden zijn de expressievectoren die kloneringsvectoren die ook de signalen voor eiwitsynthese bevatten.

Essay # 4. DNA-bibliotheek:

Het kan ook worden aangeduid als Gene-bibliotheek. Zoals de term 'bibliotheek' betekent; DNA-bibliotheek is de verzameling klonen die verschillende DNA-sequenties van een organisme dragen. Een DNA-bibliotheek is dus een mengsel van vele DNA-sequenties die in vector A zijn gekloneerd. Een DNA-bibliotheek is gunstig voor isolatie van één of meer verwante genen van een organisme en ook voor opslag en analyse van verschillende genen.

Op basis van de gebruikte DNA-bron zijn DNA-bibliotheken van twee soorten:

(i) Genomische bibliotheek

(ii) cDNA-bibliotheek.

Genomic Library:

Het is de verzameling klonen van DNA die direct is afgeleid van het genoom van een organisme. Een genomische bibliotheek vertegenwoordigt het volledige genoom van een organisme.

Stappen voor de constructie van de genomische bibliotheek zijn (figuur 9):

(a) Geheel genomisch DNA wordt uit het organisme geëxtraheerd en wordt gezuiverd.

(b) Dit gezuiverde DNA wordt vervolgens opgesplitst in fragmenten van grootte die geschikt zijn voor klonering. Fragmentatie van DNA kan worden gedaan door het gebruik van restrictie-endonuclease-enzym of door fysische methoden zoals shearing of ultrasone golven, enz.

(c) Fragmenten worden vervolgens ingevoegd in de kloneringsvectoren om recombinante DNA-moleculen te verkrijgen. Elke vector bestaat uit verschillende DNA-fragmenten.

(d) Deze populatie rec DNA-moleculen wordt vervolgens voor klonering naar de gastheercel overgebracht.

(e) Een verzameling van dergelijke fragmenten die op deze manier zijn gekloneerd, wordt een genoombibliotheek genoemd. De genomische bibliotheek voor organismen met grotere genomen worden geconstrueerd met X-faag of kunstmatige chromosoomvectoren zoals YAC, BAC, enz. Terwijl plasmidevectoren worden gebruikt voor de constructie van genomische bibliotheek voor organismen met kleinere genomen zoals bacteriën.

Essay # 5. cDNA Library:

cDNA staat voor complementair DNA. Een cDNA-bibliotheek wordt bereid uit mRNA's door het gebruik van enzym reverse transcriptase.

Stappen voor de constructie van cDNA-bibliotheek zijn (Fig. 10):

(a) mRNA's worden geïsoleerd uit de actieve weefsels die eiwitten synthetiseren.

(b) Een geschikte oligonucleotide-primer wordt aan het 3'-uiteinde van mRNA toegevoegd.

(d) Als een resultaat wordt een RNA-DNA-hybride verkregen waaruit het RNA wordt verwijderd door alkalische hydrolyse of door RNase-enzym.

(e) Nu is er slechts een cDNA-streng die zijn eigen complementaire streng synthetiseert door gebruik te maken van zijn 3'-uiteinde als een primer.

(f) Een haarspeldlus wordt gevormd die wordt verteerd door een specifiek enzym dat resulteert in de vorming van een DNA-duplex.

(g) Een aantal van dergelijke DNA-duplexen wordt gegenereerd door verschillende mRNA-templates te gebruiken en wordt verzameld als een cDNA-bibliotheek.