Plasmiden: overdracht van plasmide-DNA en zijn eigenschappen

Lees dit artikel om informatie te krijgen over de overdracht van plasmide-DNA en zijn eigenschappen.

Plasmiden zijn extra chromosomale circulaire DNA-moleculen die worden aangetroffen in de meeste bacteriesoorten en in sommige soorten eukaryoten. Onder normale omstandigheden is een bepaald plasmide niet nodig voor zijn gastheercel. Veel plasmiden bevatten plasmidengenen die in bepaalde omgevingen essentieel kunnen zijn, bijv. 'R' plasmide dragende genen die resistentie bieden tegen talrijke antibiotica zodat de cel die dit plasmide bevat, antibioticumwerking kan weerstaan.

Met slechts één uitzondering (moordenaarsplasmide van gist, een RNA-molecuul) zijn alle bekende plasmiden superrond circulair DNA. Het molecuulgewicht varieert van 106 - ¹⁰⁸ . Het aantal kopieën van een plasmide / cel varieert van 1-2 tot 10-60.

Plasmide-DNA kan uit bacteriën worden geïsoleerd door het kweken van plasmide-bevattende bacteriën. Er wordt wasmiddel aan toegevoegd om bacteriën te laten lyseren. Het lysaat wordt gecentrifugeerd. Het kleinere plasmide-DNA blijft in het supernatant. CsCI en ethidiumbromide worden toegevoegd aan het supernatant. CsCI vormt een dichtheidsgradiënt. Het supercoiled DNA met hoge dichtheid kan worden geïdentificeerd door ethidiumbromide en gemakkelijk worden verwijderd.

Overdracht van plasmide-DNA:

De bacterie E. coli heeft twee soorten paring, dwz donors of mannelijke en ontvangende of vrouwelijke. De determinant van mannelijkheid is het 'F' of geslachtsplasmide of de donor, een mannelijke cel wordt aangeduid als F ⁺ . Vrouw mist 'F'-plasmide en wordt aangeduid als F-. Wanneer de kweek van mannelijk en vrouwelijk wordt gemengd, vindt conjugatie plaats tussen paren man-vrouw. Vervoegingsbrug wordt gevormd (afb. 42.1). Koppelen induceert herhalende rollende cirkelreplicatie van 'F' Eén kopie van 'F' wordt overgebracht naar de vrouwelijke ma-minuut.

Het vrouwtje wordt omgezet in een man die vaak koppelt, de ontvangende cel bevat het 'F'-plasmide. Tijdens de overdracht vertonen zowel donor- als ontvangercellen DNA-synthese. Bij donor vervangt de synthese de enkelstreng die moet worden overgedragen, synthese in de ontvanger zet de overgebrachte enkele streng om in dubbelstrengig DNA.

'F' plasmide heeft het vermogen om te integreren in het bacteriële chromosoom. 'F' smelt samen met het chromosoom neemt toe. De cel wordt nu Hfr-cel (hoogfrequente recombinatie) genoemd. Wanneer een cultuur van Hfr wordt gemengd met F ^- cultuur, treedt conjugatie op. Replicatie start in de Hfr-cel en een replicatie wordt overgebracht naar de F ^- cel. De richting van replicatie is zodanig dat een klein deel van 'F' eerst wordt overgedragen en het grootste deel later wordt overgedragen. Vrouw krijgt zowel kleine als een grote fragmenten van het mannelijke chromosoom (figuur 42.2).

Een Hfr wordt geproduceerd wanneer 'F' stabiel in het chromosoom integreert. Een plasmide met zowel 'F', genen als chromosomale genen wordt 'F' -plasma genoemd.

Eigenschappen van Plasmids:

'F'-plasmiden:

Ze worden gebruikt als kloningshulpmiddel bij genetische manipulatie.

'R' Plasmid:

Geneesmiddelresistentie of 'R'-plasmide werden eerst geïsoleerd uit de bacterie Shigella dysenteriae en vervolgens uit E. coli, Staphylococcus, Pseudomonas, Bacillus, Vibrio, Salmonella, etc.' R'-factor verschaft resistentie tegen schimmel-antibiotica. Het 'R'-plasmide bestaat uit 2 aaneengesloten DNA-segmenten. Een daarvan is RTF (weerstandsoverdrachtsfactor).

Het draagt ​​genen die DNA-replicatie reguleren. Het heeft een molecuulgewicht van 11 x 106, de andere segment r-determinant is variabel in grootte (100 x 106 moleculair gewicht) en draagt ​​genen voor antibioticumresistentie. Resistentie tegen het geneesmiddel penicilline (pen), ampicilline (amp), chlooramfanicol (cam), streptomycine (str), kanamycine (kan) en sulfonamide (sul), is in combinatie gebruikelijk (Fig. 42.3).

Col Plasmid:

Colplasmide is E.coli-plasmide dat codeert voor colcinen, eiwitten die in staat zijn om groei van een bacteriestam die geen col-plasmide bevat te voorkomen. Colplasmiden zijn een klasse van het algemene type plasmide, bacteriocinogeen plasmide genaamd, dat in veel bacteriesoorten bacteriocinen produceert. Bacteriocines, waarvan kolieken een voorbeeld zijn dat eiwitten zijn die binden aan de celwand van gevoelige bacteriën en essentiële processen remmen, bijv. Replicatie, transcriptie, translatie of energiemetabolisme, etc. Het best bestudeerde col plasmide is col E1, met een mol gew. 4, 2 x 10 ⁶ . Het wordt gebruikt in recombinatie-DNA-onderzoek en in een in vitro DNA. replicatiesysteem.

Ti-plasmide:

Crown gal tumor wordt veroorzaakt door Agrobacterium tumefaciens. Ti-plasmide is het belangrijkste hulpmiddel bij de genetische manipulatie van planten. De wonden zijn geïnfecteerd door A. tumefaciens en induceren tumor op de locatie (figuur 42.4). Bij het begin van de infectie beginnen ze een arginine-derivaat te synthetiseren dat men opine noemt, bijv. Nopaline of octopine en de cellen prolifereren om tumor te vormen.

De inductie van de tumor wordt gecontroleerd door genetische informatie die wordt gedragen op plasmide genaamd Ti-plasmide. T-DNA- en vir-regio van het Ti-plasmide is essentieel voor transformatie van plantencellen. De plasmide-veroorzakende tumor is Ti-plasmide. In een geïnfecteerde plant komen enkele van de bacteriën binnen in de plantencel en groeien daar en laten hun DNA vrij in de cel.

Het kleine fragment van Ti-plasmide dat genen voor replicatie bevat, wordt geïntegreerd in de chromosomen van de plantencel. Het geïntegreerde fragment breekt het hormonaal gereguleerde systeem en de controle celverdeling af. De cel wordt tumorcel. Ti-plasmide van Agrobacterium tumefaciens biedt een uitstekend gentransfersysteem voor gebruik in tweezaadlobbige planten. Het hostbereik is beperkt tot alleen tweezaadlobbigen. Fig. 42.5 Ti-plasmiden zijn erg belangrijk omdat specifieke genen in het Ti-plasmide kunnen worden geïnsereerd door recombinante DNA-technieken. Deze genen kunnen worden ingevoegd in het chromosoom van de plant waardoor het genotype of fenotype van de plant verandert. Nieuwe variëteiten van waarde worden geproduceerd.

Gistplasmide:

Gist heeft killer-deeltje dat dubbelstrengs RNA-molecuul is. Het is het enige plasmide zonder DNA. Het bevat 10 genen voor replicatie en verschillende andere voor de synthese van killers (colicine-achtige substantie).

Gistplasmide is 3 μm plasmide en mol. gew. 4 × 10 ⁶ . 60 kopieën van deze plasmide / cel worden gevonden in de gistkern. Plasmide gebruikt dezelfde enzymen die nodig zijn voor replicatie van de gistchromosomen. Het plasmide integreert kennelijk niet in het gastheer-DNA. Dit plasmide is een bruikbaar systeem voor het bestuderen van DNA-replicatie in gist. Het fungeert als een vector voor het kloneren van vreemde genen in gist door de recombinatie DNA-technieken.