Bacteriën aanwezig in een monster door middel van seriële verdunning Agar-plateringswerkwijze of totale plaattelling (TPC) -methode
Total Plate Count (TPC):
Om bacteriën op te noemen die aanwezig zijn in een monster door middel van seriële verdunningsagarplateringswerkwijze of totale plaattelling (TPC) methode.
Doel:
De mate van bacteriële activiteit in een bepaald monster in een bepaald stel omstandigheden hangt voornamelijk af van het totale aantal bacteriën dat erin aanwezig is, ongeacht hun soort.
Daarom is het vaak nodig om het totale aantal bacteriën in monsters van voedsel, water, bodem, lucht en weefsel te achterhalen tijdens hun microbiologische analyse. Dit totale aantal bacteriën omvat zowel levende als dode bacteriën. ' Dode bacteriën kunnen niet groeien en zich voortplanten.
Het zijn alleen de levende bacteriën (levensvatbare bacteriën) die kunnen groeien en zich kunnen vermenigvuldigen, wat resulteert in specifieke bacteriële activiteit. Daarom is het vaak nodig om de levensvatbare bacteriecellen in verschillende monsters op te sommen. De meeste van de opsommingsmethoden zoals directe microscopische telling, elektronische celaantallen, chemische methoden en spectrofotometrische methode tellen echter zowel levende als dode cellen.
Deze methoden kunnen geen onderscheid maken tussen levende en dode cellen. Daarom is seriële verdunningsagarplateringswerkwijze, die alleen de levensvatbare bacteriecellen opsomt, de universeel gebruikte methode voor het tellen van levende levensvatbare cellen in verschillende monsters.
Beginsel:
Een bepaald gewicht aan vast monster wordt aseptisch gehomogeniseerd in negen volumina steriele zoutoplossing om een homogene suspensie van bacteriën te verkrijgen. Het vloeibare monster wordt direct gebruikt als homogene suspensie van bacteriën. De aldus verkregen suspensies van bacteriën worden serieel verdund (10 maal, 100 maal, 1000 maal etc.). Hier 10-1, 10 -2, 10 -3 enz. Worden verdunningen genoemd.
Hun reciprocals (10 1, 10 2, 10 3 enz.) Worden verdunningsfactoren genoemd. Een bepaald volume van de suspensie van bacteriën uit elke verdunning wordt op agarplaten geïnoculeerd en goed verspreid, om de afzonderlijke bacteriëncellen wijd uit elkaar te plaatsen en ze van elkaar te isoleren.
De inoculatie van bacteriën voor zijn opsomming gebeurt als volgt in twee technieken:
1. Gietplaattechniek
2. Spreidplaattechniek
1. Gietplaattechniek:
Bij deze techniek wordt 1 ml van de bacteriesuspensie op een gesteriliseerde petrischaal neergelaten en vervolgens wordt er vloeibaar voedingsagarmedium over gegoten. De petrischaal wordt zachtjes gewerveld, zodat de suspensie gelijkmatig met het medium kan worden gemengd. Het is toegestaan af te koelen en te stollen.
2. Spread Plate Technique:
In deze techniek wordt 0, 1 ml van de bacteriesuspensie op een bereide agarplaat gedruppeld. Vervolgens wordt de druppel suspensie uniform verspreid op de agarplaat door een gesteriliseerde glasverspreider.
Om fouten te minimaliseren, wordt elke verdunde suspensie uitgeplaat op 2-5 replicaatplaten. De geënte platen worden 24 uur geïncubeerd bij 37 ° C. Gedurende deze periode groeit elke geïsoleerde individuele bacteriecel op de agarplaat en vermenigvuldigt zich snel om een macroscopische zichtbare massa van bacteriecellen te produceren die een 'kolonie' wordt genoemd. Het aantal kolonies op de plaat vertegenwoordigt dus het aantal bacteriën in het monster.
Heel vaak echter, tijdens het verspreiden, worden sommige cellen mogelijk niet goed gescheiden en kunnen weinig van dergelijke niet-gescheiden cellen aanleiding geven tot een enkele kolonie. Bovendien hebben weinig cellen de neiging om in paren, ketens of clusters te blijven.
Hier produceert elk paar, elke ketting of elk cluster een kolonie. Daarom vertegenwoordigt elke kolonie, in strikte zin, geen enkele bacterie. Dat is waarom, in plaats van de tellingen van bacteriën uit te drukken als 'Nee. van bacteriën / gm of ml monster ', wordt het zeer vaak uitgedrukt als aantal kolonievormende eenheden per gm of ml (CFU / gm of ml).
Het totale aantal platen (TPC) in het oorspronkelijke monster wordt berekend door het aantal CPU's te vermenigvuldigen met de respectieve verdunningsfactoren. De 'regels van opsomming' worden gevolgd, terwijl het aantal bacteriën in het originele monster wordt berekend.
Vereiste materialen:
Petrischalen (15 nrs.), Pipetten van 2 ml (10 nrs.), Pipet van 10 ml (1 nr.), Reageerbuisjes (10 nrs.), Erlenmeyers (500 ml en 1 liter - 1 nr. Elk), Bekerglas van 500 ml (2 nrs.), Glazen strooier, roestvrijstalen pipetkist, handgeschept papier, draad (of rubberen band), niet-absorberend katoen, ethylalcohol, natriumchloride (NaCl), 0, 1N zoutzuur (HCI), 0, 1 N natriumhydroxide (NaOH), gedestilleerd water, voedingsagar, vloeibaar monster (bijv. Vijverwater / rioolwater), vast monster (bijv. Grond / visvlees / oestervlees / verwerkte levensmiddelen), pH-papier (of pH-meter), stamper en mortel (of homogenisator), bunsenbrander, heteluchtoven, autoclaaf, incubator, laminaire stromingskamer, Quebec kolonie teller.
Procedure:
1. Tien pipetten (in een roestvrijstalen pipetkoker), 15 petrischalen en een stamper en vijzel (of één homogenisatorbeker) worden gedurende 3 uur gesteriliseerd in een heteluchtoven op 180 ° C. Als alternatief kunnen ze worden afgedekt met handgeschept papier, verbonden met een draad of rubberen band en gesteriliseerd in de autoclaaf samen met het medium (figuur 6.6).
Het aantal petrischalen en dienovereenkomstig de hoeveelheid toe te passen medium wordt berekend afhankelijk van het aantal replicaties en verdunningen dat is vereist. Hier zijn de glaswerk en het medium genomen voor een enkele replicatie en verdunning tot 10 -6 . Het aantal glasswares en de hoeveelheid genomen medium voor sterilisatie is iets meer om eventuele incidentele fouten te voorkomen, omdat sterilisatie een langdurig proces is.
2. 4, 25 g NaCl wordt opgelost in 500 ml gedestilleerd water om fysiologische zoutoplossing te verkrijgen (0, 85%). 225 ml van deze zoutoplossing wordt in een erlenmeyer van 500 ml gegoten. De mond is van katoen, verstopt, bedekt met ambachtelijk papier en vastgemaakt met draad of rubberen band. Het wordt gebruikt als de eerste verdunningsmiddelen om het vaste monster te verdunnen.
3. 9, 0 ml van de overgebleven zoutoplossing wordt ook in elk van de 10 reageerbuizen gepipetteerd. Hun mond is van katoen, verstopt, bedekt met handgeschept papier en vastgemaakt met draad of rubberen band. Deze worden gebruikt als verdunningsmiddelen voor seriële verdunning.
4. De ingrediënten van voedingsagarmedium of het kant-en-klare poeder dat voor 500 ml van het medium is vereist, worden gewogen en opgelost in 500 ml gedestilleerd water in een erlenmeyer van 1 liter door schudden en zwenken.
De pH wordt bepaald met behulp van een pH-papier of pH-meter en bijgesteld tot 7, 0 met 0, 1 N HC1 als het meer is of met 0, 1 N NaOH als dit minder is. De kolf wordt verwarmd om de agar volledig in het medium op te lossen. Daarna is het met katoen verstopt, bedekt met handgeschept papier en vastgemaakt met draad of rubberen band.
5. De erlenmeyer van 500 ml met 225 ml zoutoplossing, de 10 reageerbuisjes met elk 9 ml zoutoplossing en de erlenmeyer van 1 liter met 500 ml agarmedium voor voeding worden gedurende 15 minuten bij 121 ° C (15 psi-druk) gesteriliseerd in een autoclaaf.
6. Na sterilisatie worden de gesteriliseerde materialen uit de autoclaaf verwijderd en men laat deze enige tijd afkoelen zonder het medium te laten stollen. Koeling van het medium voorkomt condensatie en ophoping van waterdruppeltjes in de platen. Als het medium al tijdens opslag is bereid en gestold, moet het vloeibaar worden gemaakt door het voorzichtig te verhitten totdat het volledig is gesmolten.
7. Om agarplaten te bereiden, voordat het gesteriliseerde voedingsagarmedium afkoelt en stolt, in warme gesmolten toestand, wordt het aseptisch in de 6 gesteriliseerde petrischalen gegoten (ongeveer 20 ml elk), zodat het gesmolten medium de bodem van de petri bedekt. gerechten volledig.
Vervolgens worden de platen bedekt met hun deksels en men laat ze afkoelen om het medium daarin te laten stollen. Waterdamp die kan condense- ren op het binnenoppervlak van de platen en deksels wordt verdampt door de platen en de deksels in omgekeerde positie te houden in een incubator bij 37 ° C gedurende ongeveer 1 uur.
8. 25 g van het vaste monster (bijv. Visvlees / oestervlees / verwerkte levensmiddelen) is gewicht en wordt aseptisch in 225 ml gesteriliseerde zoutoplossing (verdunningsmiddel) gehomogeniseerd (figuur 6.7). Dit levert een 10-voudige verdunning op (verdunning = 10 -1 ). Voor het vloeibare monster wordt 1 ml monster aseptisch gepipetteerd in een gesteriliseerde zoutoplossingbuis van 9 ml. Dit geeft ook een 10-voudige verdunning (verdunning = 10 -1 ).
9. 1 ml van de 10 -1 verdunning wordt overgebracht naar 9 ml gesteriliseerde zoutoplossing in een andere reageerbuis. Dit geeft 100 maal verdunning (verdunning = 10-2 ). Van de 10-2 verdunning wordt 1 ml gedruppeld in een gesteriliseerde petrischaal en 0, 1 ml op een agarplaat uit dezelfde pipet. Voor elke verdunning wordt een afzonderlijke gesteriliseerde pipet gebruikt. Na gebruik wordt het gedompeld in de wegwerppot.
10. 1 ml van de 10-2 verdunning wordt overgebracht naar 9 ml gesteriliseerde zoutoplossing in een andere reageerbuis. Dit geeft 1000 maal verdunning (verdunning = 10-3 ). Uit de 10-3- verdunning wordt 1 ml in een gesteriliseerde petrischaal en 0, 1 ml op een agarplaat uit dezelfde pipet neergeslagen. Op vergelijkbare wijze wordt de verdunning tot 10 -6 in serie voortgezet, waarbij telkens 1 ml wordt overgebracht naar een gesteriliseerde petrischaal en 0, 1 ml naar een agarplaat uit dezelfde pipet.
11. Vervolgens worden de druppels suspensie op de agarplaten aseptisch verspreid door een gesteriliseerde glasverspreider. Nadat het in elke plaat is verspreid, wordt het door middel van vlammen gesteriliseerd door onder te dompelen in alcohol en door een vlam te laten zien. Dit is de 'spread plate technique'.
12. De petrischalen die elk 1 ml bacteriesuspensie bevatten, worden afgenomen en er wordt gesteriliseerde vloeibare agar-voedingsstof in gegoten. Ze worden zachtjes gewerveld, zodat de suspensie op uniforme wijze kan worden gemengd met het medium. De platen worden toegestaan af te koelen totdat het medium stolt. Dit is 'gietplaat-techniek'.
13. Vervolgens worden de platen geïncubeerd in omgekeerde positie, van boven naar beneden, bij 37 ° C gedurende 24 uur in een incubator (figuur 6.7).
14. Een niet-geïnoculeerde agarplaat wordt geïncubeerd als controle om juiste sterilisatie te verzekeren zoals getoond door geen groei op het.
opmerkingen:
Het aantal kolonies van bacteriën op de platen wordt direct geteld of met behulp van een Quebec kolonie teller. Hieruit wordt het aantal bacteriën per gram of ml van het oorspronkelijke monster berekend. Dit wordt opsomming genoemd.
Regels van opsomming:
1. Petrischalen met 30 tot 300 kolonies moeten worden overwogen.
2. Gemiddelde aantallen duplicaten en triplo's (R 1, R 2 R 3 ...) worden alleen in aanmerking genomen als één telling niet meer is dan het dubbele van de andere. Als men meer dan het dubbele is van de andere, wordt een lagere waarde genomen.
3. Voor gietplaattechniek is het bacterietelling No. X 10 c / gm, waarbij c = verdunningsfactor. Voor spreidplaattechniek is het aantal bacteriën X10 c + 1 / g, waarbij c = verdunningsfactor. Het nummer wordt geconverteerd naar twee decimalen in de vorm van (x.yz X 10 m ). 288 X 104 wordt bijvoorbeeld uitgedrukt als 2, 88 X 106.
4. Als in alle verdunningen het aantal kolonies meer dan 300 is, telt dit voor de hoogste verdunning en als het in alle verdunningen minder dan 30 is, wordt het aantal voor de laagste verdunning beschouwd. In beide gevallen wordt de telling weergegeven als: Geschat nummer X 10 c / gm of ml voor gietplaattechniek en geschat aantal X 10 c + 1 / gm of ml voor spreidplaattechniek.
5. Als geen enkele kolonie wordt waargenomen in een genomen verdunning, wordt dit weergegeven als: geschat <1 x laagste verdunning.
6. Aangezien de seriële verdunning plaatsvindt in termen van 10 keer, is het wiskundig duidelijk dat geen twee verdunningen kolonies tussen 30 en 300 kunnen hebben. Als 10 -3 bijvoorbeeld 50 kolonies heeft, zou 10 -2 500 moeten hebben (dwz> 300) en 10 -4 zou 5 (dwz <30) kolonies moeten hebben.
Dit gebeurt echter niet in de realiteit, omdat bacteriën niet voorkomen als een homogene oplossing; komt eerder voor als een suspensie in de verdunningsmiddelen. Als er twee verdunningen zijn met telbare kolonies (tussen 30 en 300) bereken eerst het aantal kolonievormende eenheden / gm of ml met behulp van elke verdunning.
Als de ene waarde meer dan het dubbele van de andere is, rapporteer dan de lagere waarde. Als dat niet het geval is, neemt u het gemiddelde van de twee waarden en rapporteert u die waarde.
