Enzyme-Linked Immnoabsorbent Assay (ELISA) Methoden voor het detecteren van antigeen

Enzyme-Linked Immnoabsorbent Assay (ELISA) Methoden voor het detecteren van antigeen!

Enzym-gekoppelde immnoabsorberende methoden kunnen worden gebruikt voor het detecteren van elk antigeen of antilichaam. De ELISA-methode heeft veel voordelen ten opzichte van andere methoden (tabel 27.2).

ELISA-methode is 10 tot 1000 voudig gevoelig dan de oudere methoden zoals agglutinatie en immuno-elektroforese. Een verscheidenheid aan modificaties van ELISA zijn beschikbaar, waarvan sommige hier worden beschreven.

Tabel 27.2: Voordelen van enzymimmunoassays

1. Amplificatie-effect van enzymen resulteert in de ontwikkeling van meer gevoelige assays

2. Reagentia hebben een lange houdbaarheid en zijn relatief goedkoop

3. Er kan een grote verscheidenheid aan assayconfiguraties worden ontwikkeld

4. Apparatuur is minder duur en op grote schaal beschikbaar

5. Geen stralingsgevaren

6. Kan ook in kleine laboratoria worden uitgevoerd

ELISA om antilichamen te testen:

Bekend antigeen is gecoat op putjes van microliterplaten (kleine plastic plaat, behandeld om de eiwitbinding te maximaliseren, bevat 96 putjes met een volume van 200 μl).

↓

Menselijk testserum wordt aan het putje toegevoegd en geïncubeerd.

ik. Als het serum antilichamen tegen het gecoate antigeen bevat, binden de antilichamen aan de antigenen.

↓

De putjes worden gewassen om ongebonden serumcomponenten te verwijderen.

↓

Enzym geconjugeerd anti-humaan immunoglobuline (bekend als conjugaat) wordt aan de putjes toegevoegd en geïncubeerd.

ii. Het conjugaat bindt aan de antigeen-gebonden antilichamen in de put.

iii. Als het testserum geen antilichamen tegen het antigeen bevat, blijft het conjugaat in de oplossing achter.

↓

De putjes worden gewassen om ongebonden conjugaat te verwijderen.

↓

Een geschikt substraat wordt aan de putjes toegevoegd en geïncubeerd.

iv. Het enzym van het conjugaat in het antigeen-antilichaam-conjugatencomplex werkt op het substraat en splitst het substraat om een ​​gekleurd product te produceren. Ontwikkeling van kleur geeft aan dat antilichaam dat specifiek is voor het antigeen gecoat op de putjes aanwezig is in het testserum.

v. Niet-ontwikkeling van kleur geeft aan dat het testserum geen antilichamen tegen het antigeen gecoat op de putjes heeft.

↓

Een stopoplossing (meestal IN zwavelzuur) wordt toegevoegd om de reactie te stoppen. Vervolgens wordt de plaat in een ELISA-lezer gehouden en wordt de optische dichtheid (OD) van de putjes gemeten. De OD komt overeen met de hoeveelheid antilichaam in het testserum.

Door bekende concentraties van antilichamen te gebruiken, kan een grafiek worden geconstrueerd. De antilichaamconcentraties zijn uitgezet op de X-as en de overeenkomstige OD's zijn uitgezet op de Y-as en er is een curve getekend. Door de OD-waarde van het testserum te interpoleren, wordt de concentratie van antilichamen in een testserum bepaald.

ELISA to Assay Antigen:

Een bekend monoklonaal antilichaam (waarnaar wordt verwezen als primair antilichaam) aan een antigeen wordt gecoat op de microtiterputjes.

↓

Het monster waarvan wordt verondersteld dat het het antigeen bevat, wordt aan het putje toegevoegd en geïncubeerd.

ik. Als het monster het overeenkomstige antigeen bevat, bindt het antigeen aan het antilichaam op het putje en vormt het een antigeen-antilichaamcomplex.

↓

De putjes worden gewassen om ongebonden materialen te verwijderen.

↓

Een bekend enzym-geconjugeerd mAb (genoemd als conjugaat) tegen het antigeen wordt aan de putjes toegevoegd en de plaat wordt geïncubeerd.

ik. Als de put een antigeen-antilichaamcomplex bevat, bindt het conjugaat aan het antigeen in het complex.

ii. Als er geen antigeen-antilichaamcomplex is, blijft het conjugaat in oplossing.

↓

De putjes worden gewassen om het ongebonden conjugaat te verwijderen. Een geschikt substraat wordt toegevoegd en geïncubeerd.

ik. Als er conjugaat in de put is, splitst het enzym van het conjugaat het substraat en produceert een gekleurd product.

iii. Afwezigheid van kleurontwikkeling geeft aan dat er geen antigeen in het monster zit (tegen het antilichaam dat op de putjes is gecoat).

↓

Een stopoplossing wordt toegevoegd om de reactie te stoppen. OD's van de individuele wells worden gelezen in de ELISA-lezer. Zoals eerder uitgelegd, wordt een grafiek (bestaande uit verschillende concentraties van antigenen op de X-as en de overeenkomstige OD's op de Y-as) geconstrueerd en wordt de curve getekend. De concentratie van het antigeen in het testmonster wordt bepaald door interpolatie van zijn OD.

Antilichaam Capture ELISA-methode:

Putjes van de microtiterplaat zijn bekleed met anti-humane IgM-antilichamen.

↓

Het serum van de patiënt wordt toegevoegd en geïncubeerd. De IgM-antilichamen in het serum binden aan de anti-humane IgM-antilichamen op de putjes.

De putjes worden gewassen en vervolgens wordt een bekend antigeen toegevoegd en geïncubeerd.

ik. Als IgM-antilichamen tegen het antigeen in de put aanwezig zijn, zal het antigeen aan het IgM-antilichaam binden en in de put blijven.

↓

De putjes worden gewassen om niet-gebonden antigeen te verwijderen

↓

Een enzym-geconjugeerd mAb aan het antigeen wordt toegevoegd en geïncubeerd.

ik. Als antigeen in de put aanwezig is (anti-IgM-IgM-antigeencomplex), zal het conjugaat binden aan het antigeen.

↓

De putjes worden gewassen om ongebonden conjugaat te verwijderen en substraat wordt toegevoegd.

ik. Ontwikkeling van kleur geeft aan dat IgM-antilichamen tegen het antigeen in het serum van de patiënt aanwezig zijn.

ii. Niet-ontwikkeling van kleur geeft aan dat het serum van de patiënt geen IgM-antilichamen tegen het antigeen bevat.

↓

Stopoplossing wordt toegevoegd en de OD's van putjes worden afzonderlijk gemeten in de ELISA-lezer. De hoeveelheid IgM-antilichamen tegen het antigeen kan worden bepaald door een grafiek te tekenen zoals eerder is beschreven.

Een vergelijkbare procedure kan worden toegepast om IgG-antilichamen tegen een antigeen te detecteren.

De enzymen die gewoonlijk worden gebruikt in de ELISA-technieken zijn mierikswortelperoxidase en alkalische fosfatase (tabel 27.3). Deze enzymen zijn covalent gekoppeld aan mAbs. Een verscheidenheid van substraten worden door deze enzymen in werking gesteld om gekleurde producten te produceren. Omdat de laatste stap van de ELISA-methode enzymatisch is, is de ELISA-methode uiterst gevoelig (dwz dat zeer lage concentraties van antigeen of antilichaam detecteerbaar zijn).

De gevoeligheid van ELISA-testen wordt verhoogd door extra reagentia te gebruiken (bijvoorbeeld biotine / avidine-immunoassay). Onlangs heeft het gebruik van mierikswortelperoxidasesubstraten die chemiluminescente producten produceren de gevoeligheid verder verhoogd. Meting van de snelheid van de reactie, in plaats van de mate van de reactie op een enkel vast moment, geeft meer nauwkeurige kwantitatieve ELISA-resultaten.

Tabel 27.3: Kenmerken van enzymen die worden gebruikt in enzymimmuuntests:

Biotine-Avidin Enhanced ELISA:

In plaats van het mAb te labelen met een enzym, kan het MAb worden gelabeld met biotine (vitamine B12).

↓

Vervolgens wordt enzym-gemerkt avidine (een eiwitcomponent van het eiwit) toegevoegd.

↓

Avidine bindt zich aan biotine met een zeer hoge gevoeligheid en affiniteit. Vervolgens wordt het substraat toegevoegd. Het enzym (in het mAb-biotine-avidine-enzym) complex werkt op het substraat en produceert een gekleurd product.

Biotine-avidine-enhancement wordt ook gebruikt in Immuno- fluorescente assays.

Microdeeltjes enzym Immunoassays:

In plaats van de putjes van de microtiterplaat te coaten met antigenen of antilichamen, worden kleine parels (met een diameter van 1 mm) gecoat met antigeen of antilichaam en ELISA-testen worden uitgevoerd. De microdeeltjes bieden een groter oppervlak voor antigeen- of antilichaamcoating, zodat hogere concentraties van antigeen of antilichaam gecoat kunnen worden, wat helpt bij het verkorten van de tijd die nodig is voor bindingsreacties.

Fluorescentie-enzym immunoassay is identiek aan andere EIA's behalve dat ze fluorescerende substraten gebruiken. In de fluorescerende EIA wordt de fluorofoor gegenereerd door een enzymreactie. Na excitatie van de fluorofoor bij zijn optimale golflengte, wordt licht met een karakteristieke golflengte uitgestraald. Het geëmitteerde fluorescentielicht wordt gemeten.

In de tijd opgeloste fluoro-immunoassay:

Deze methode vereist speciale instrumentatie en speciale fluorescerende labels om de assaygevoeligheid te verhogen. Het fluorescente label dat in deze test wordt gebruikt, vertoont een vertraagde fluorescentie met een tijdsperiode van 100 ns of meer tussen excitatie en emissie. De meeste stoffen die verantwoordelijk zijn voor de achtergrondfluorescentie hebben een korte vervalperiode. Daarom zal de meting van het vertraagde fluorescentiesignaal de effecten van achtergrondfluorescentie verminderen.

Dit doel wordt bereikt door het gebruik van een speciale in de tijd opgeloste fluorometer die een snelle lichtpuls produceert die de fluorofoor exciteert. Fluorescentie wordt een beetje gemeten na excitatie. Aldus kan het effect van niet-specifieke achtergrond, die in het algemeen vervalt in minder dan 10 ns, worden geëlimineerd.

De fluoroforen met vertraagde fluorescentie zijn:

ik. Pyreenderivaten met een vervaltijd van bijna 100 ns.

ii. Zeldzame aardmetaalchelaatlabels [zoals europium (Eu ³⁺ ), samarium (Sm ³⁺ ) en terbium (Tb ³⁺ )] met een zeer lange vervaltijd van ongeveer 50 tot 100 μs.

Chemiluminescente Immunoassay:

Chemiluminescente immunoassays (CL-EIA's) gebruiken chemiluminescerende substraten die reageren met verschillende enzymen. De chemiluminescerende substraat-enzymreactie genereert licht, vergelijkbaar met bioluminescentie. De chemiluminescente EIA-systemen zijn een duidelijke verbetering ten opzichte van RIA's in termen van gevoeligheid, tijdsefficiëntie en procedurele eenvoud.

Chemiluminescentie-immunoassays gebruiken chemiluminescentie genererende moleculen als labels.

ik. Luminol-derivaten

ii. Acridinium esters

iii. Nitrofenyloxalaatderivaten

iv. Ruthenium tri-bipridyl met tripropylamine voor elektrochemiluminescentie

v. In principe verschillen de testmethoden niet van RIA's / FIA's.