Teelt van bacteriën uit monsters van vaste, vloeibare en staafjes (met afbeelding)

Doel:

De belangrijkste doelen van de teelt van bacteriën zijn als volgt:

1. Toename van het aantal bacteriën, om ze in zichtbare vormen te krijgen, als kolonies of suspensies.

2. Isolatie van bacteriën.

3. Onderhoud van pure stamcultuur en standaardculturen.

4. Bepaling van bacteriën in monsters.

5. Detectie van bepaalde interessante bacteriën in een monster en de opsomming ervan.

6. Identificatie van bacteriën van koloniekarakteristieken, groeikenmerken op hellingen en biochemische activiteiten in verschillende media.

Het doel van dit experiment is echter alleen om bacteriën uit vloeibare, vaste en oppervlaktemonsters in vaste en vloeibare media te kweken, om ze in zichtbare vormen respectievelijk als kolonies of suspensie te krijgen.

Beginsel:

Bacteriën worden gekweekt in gesteriliseerde, voedingsrijke vloeibare of vaste media. De vloeibare media, bouillon genaamd, zitten in reageerbuizen om 'bouillonbuizen' te vormen, terwijl de vaste media, agar-media genoemd, in petrischalen worden bewaard om 'agarplaten' of eenvoudigweg 'platen' te vormen. Teelt van bacteriën heeft materiaal nodig waarvan wordt vermoed dat het bacteriën bevat.

De meeste dingen die we zien bevatten bacteriën. Ze zijn aanwezig in tanden schrapen, voedsel, grond, water, ontlasting en zelfs in de niet-gesteriliseerde microbiologische media zelf. Een bepaalde hoeveelheid van de homogene suspensie van een van de bacteriën bevattende materialen wordt aseptisch in de gesteriliseerde media geïnoculeerd en 24 uur in een incubator bij 37 ° C geïncubeerd.

In vloeibare bouillon groeien de bacteriën als suspensie en worden ze troebel. Op vaste agarplaten groeien ze als kolonies; elke kolonie groeit uit een enkele bacterie. Teelt van bacteriën gebeurt in de volgende vijf stappen.

1. Voorbereiding van media

2. Sterilisatie van media en glaswaren

3. Inenting

4. Incubatie

5. Observatie

1. Voorbereiding van media:

Gewoonlijk worden ter voorbereiding van vloeibare bouillon en halfvaste media de ingrediënten gewogen in de voorgeschreven verhoudingen en opgelost in de vereiste hoeveelheid water. Op dit moment zijn kant-en-klare mediapoeders met de ingrediënten in de vereiste verhoudingen beschikbaar.

Ter voorbereiding van vloeibare mediumvloeistoffen wordt de voorgeschreven hoeveelheid poeder (zoals vermeld op het etiket van de verpakking) afgewogen en opgelost in de vereiste hoeveelheid water in een erlenmeyer. De ingrediënten worden opgelost door te verwarmen, in reageerbuizen gegoten en gesteriliseerd in een autoclaaf.

Maar ter voorbereiding van vaste platen, schuine en diepe buizen, wordt de voorgeschreven hoeveelheid poeder (zoals vermeld op het etiket van de verpakking) gewogen en opgelost in de vereiste hoeveelheid water in een erlenmeyer. Dit bereide medium wordt eerst gesteriliseerd in een autoclaaf en vervolgens enige tijd afgekoeld.

Terwijl het nog warm is voordat het stolt, wordt het in gesteriliseerde petrischalen of reageerbuizen gegoten en laat men het stollen bij afkoelen tot kamertemperatuur. Media, in zeer hete staat, mogen nooit in containers worden gegoten, omdat dit leidt tot condensatie van water op de wand van de containers, dat op het oppervlak van de media valt en kan leiden tot vervuiling.

2. Sterilisatie:

Glasswares worden gesteriliseerd in een heteluchtoven bij 180 ° C gedurende 3 uur en media in een autoclaaf bij 121 ° C (15 psi druk) gedurende 15 minuten. Glasswares kunnen ook in de autoclaaf worden gesteriliseerd, maar media mogen nooit in de oven worden gesteriliseerd, omdat er water uit de media komt en ze uitdrogen.

3. Inenting:

Vloeistofmonsters worden verondersteld homogene suspensies van bacteriën te zijn. Daarom wordt voor het kweken in bouillon een bepaald volume van het monster aseptisch in de bouillon gepipetteerd. Voor kweken op agarplaten wordt een bepaald volume van het monster op de vaste agarplaat gepipetteerd en aseptisch op het oppervlak van het medium uitgespreid.

Voor vaste monsters wordt een monster van bepaald gewicht aseptisch gehomogeniseerd in een bepaald volume van normale fysiologische zoutoplossing (0, 85% natriumchloride) met behulp van een gesteriliseerde stamper en mortier of een menger. De meeste menselijke ziekteverwekkers zijn isotoon voor het menselijk lichaam (0, 85% natriumchloride).

Gewoonlijk is de verhouding van monster tot zoutoplossing 1: 9 (1 g + 9 ml; 10 g + 90 ml; 25 g + 225 ml of 50 g + 450 ml). Een bepaald volume van deze gehomogeniseerde vloeistof, die wordt verondersteld een homogene suspensie van bacteriën te zijn, wordt aseptisch gepipetteerd naar de gesteriliseerde bouillon in reageerbuizen voor bouilloncultuur. Voor kweken op agarplaten wordt de vloeibare suspensie op het oppervlak van de platen gepipetteerd en aseptisch verspreid.

Voor oppervlaktemonsters genomen om de microbiologie van vaste oppervlakken (tafelbladen, lichaamsoppervlakken of wonden) te bestuderen, wordt het oppervlak ingewreven met een gesteriliseerd wattenstaafje. Het staafje wordt tegen het oppervlak van een gesteriliseerde agarplaat gedrukt. Vanaf het aanrakingspunt worden strepen door een gesteriliseerde lus aseptisch gemaakt, om de bacteriën te isoleren.

4. Incubatie:

De geënte bouillonbuizen en -platen worden 24 uur geïncubeerd bij 37 ° C in een incubator.

5. Observatie:

Troebelheid in vloeibare bouillon en kolonies op agarplaten duiden op groei van bacteriën.

Materiaal vereist:

Petrischalen (6 nrs.), Pipetten van 2 ml (5 nrs.), Reageerbuizen (5 nrs.), Erlenmeyers (100 ml, 250 ml en 500 ml-l elk), bekerglas van 250 ml (2 nrs.), Glas strooier, roestvrijstalen pipetkist, handgeschept papier, draad (of rubberen band), niet-absorberend katoen, kleine staafjes, lus, ethylalcohol, natriumchloride (NaCl), 0.1N zoutzuur (HCI), 0.1N natriumhydroxide (NaOH ), gedestilleerd water, voedingsbodem, agar-voedingsmiddel, vloeibaar monster (bijv. vijverwater), vast monster (bijv. aarde), oppervlaktemonster (bijv. tafelblad, lichaamsoppervlak, wond), pH-papier (of pH-meter), stamper en vijzel (of homogenisator), bunsenbrander, heteluchtoven, autoclaaf, incubator, laminaire stromingskamer.

Procedure:

1. Vijf pipetten (in een roestvrijstalen pipetkoker), zes petrischalen en een stamper en vijzel (of één homogenisatorbeker) worden gedurende 3 uur bij 180 ° C in een heteluchtoven gesteriliseerd. Als alternatief kunnen ze worden afgedekt met handgeschept papier, gebonden met draad of rubberen band en gesteriliseerd in de autoclaaf samen met de media (Figuur 6.1).

2. 0, 85 g NaCl wordt opgelost in 100 ml gedestilleerd water in een bekerglas van 250 ml en 90 ml van deze zoutoplossing wordt in een erlenmeyer van 100 ml gegoten. De mond is van katoen, verstopt, bedekt met ambachtelijk papier en vastgemaakt met draad of rubberen band.

3. De ingrediënten van voedingsbodemmedium die vereist zijn voor 100 ml bouillon worden gewogen. Als alternatief wordt de voorgeschreven hoeveelheid kant-en-klaar voedingsbodempoeder (ingrediëntmengsel) gewogen.

4. De ingrediënten (of het kant-en-klare poeder) worden opgelost in 100 ml gedestilleerd water in een erlenmeyer van 250 ml door schudden en zwenken. De pH wordt bepaald met behulp van een pH-papier of pH-meter. De pH wordt bijgesteld tot 7, 0 met 0, 1 N HCl als dit meer is of met 0, 1 N NaOH als dit minder is. De kolf wordt, indien nodig, verwarmd om de ingrediënten volledig op te lossen.

5. De bouillon wordt verdeeld in 5 reageerbuizen (elk ongeveer 10 ml), hun mond wordt met katoen afgesloten, bedekt met ambachtelijk papier en met draad of rubberen band vastgemaakt.

6. De ingrediënten van voedingsmiddel agarmedium of het kant-en-klare poeder dat vereist is voor 200 ml van het medium worden afgewogen en opgelost in 200 ml gedestilleerd water in een erlenmeyer van 500 ml door schudden en wervelen.

De pH wordt bepaald met behulp van een pH-papier of pH-meter en bijgesteld tot 7, 0 met 0, 1 N HC1 als het meer is of met 0, 1 N NaOH als dit minder is. De kolf wordt verwarmd om de agar volledig in het medium op te lossen. Daarna is het met katoen verstopt, bedekt met handgeschept papier en vastgemaakt met draad of rubberen band.

7. Watten worden gemaakt door katoen rond de toppen van kleine stokjes te draaien. Weinig dergelijke swabs worden in een reageerbuis met de katoenen uiteinden naar beneden gehouden. De reageerbuis is van katoen, verstopt, bedekt met kraftpapier en met draad of rubberen band vastgemaakt.

8. De erlenmeyer van 100 ml met 90 ml zoutoplossing, de 5 reageerbuisjes met voedingsbodem, de erlenmeyer van 500 ml met 200 ml agarvoedingsmedium en de reageerbuis met de swabs worden gesteriliseerd bij 121 ° C (15 psi druk) voor 15 minuten in een autoclaaf.

9. Na sterilisatie worden de gesteriliseerde materialen uit de autoclaaf verwijderd en men laat deze enige tijd afkoelen zonder het medium te laten stollen. Koeling van het medium voorkomt condensatie en ophoping van waterdruppeltjes in de platen. Als het medium al tijdens opslag is bereid en gestold, moet het vloeibaar worden gemaakt door het voorzichtig te verhitten totdat het volledig is gesmolten.

10. Om voedingsagarplaten te bereiden, voordat het gesteriliseerde voedingsagarmedium afkoelt en stolt, in warme gesmolten toestand, wordt het aseptisch gegoten in de 6 gesteriliseerde petrischalen (elk ongeveer 20 ml), zodat het gesmolten medium de bodem bedekt. de petrischalen volledig.

Vervolgens worden de platen bedekt met hun deksels en men laat ze afkoelen om het medium daarin te laten stollen. Waterdamp die kan condense- ren op het binnenoppervlak van de platen en deksels wordt verdampt door de platen en de deksels in omgekeerde positie te houden in een incubator bij 37 ° C gedurende ongeveer 1 uur.

11. Het vloeibare monster (waarvan vermoed wordt dat het bacteriën bevat, bijv. Vijverwater) wordt gebruikt. Eén ml van elk van de monsters wordt aseptisch gepipetteerd in twee bouillonbuizen (Figuur 6.2). De buizen zijn gewerveld. Het vloeibare monster wordt ook aseptisch gepipetteerd op 2 agarplaten, elk 0, 1 ml, en uitgespreid op het oppervlak van het agarmedium met behulp van een met vlam gesteriliseerde glasverspreider.

Vóór elke verspreiding door de glasstrooier wordt het gedoopt in alcohol en over een bunsenbrander gebrand. De geënte bouillonbuizen en -platen worden 24 uur geïncubeerd bij 37 ° C in een incubator. De platen worden geïncubeerd in omgekeerde positie, van boven naar beneden.

12. Voor het vaste monster (bijv. Aarde) wordt 10 g van het monster aseptisch gewogen en gehomogeniseerd in de gesteriliseerde stamper en mortel of homogenisatorbeker na toevoeging van 90 ml van de gesteriliseerde zoutoplossing uit de conische kolf van 100 ml.

Deze homogene bacteriesuspensie wordt aseptisch in 2 bouillonbuizen en 2 agarplaten gepipetteerd zoals in stap 11 en 24 uur bij 37 ° C in de incubator geïncubeerd (Figuur 6.2). De platen worden geïncubeerd in omgekeerde positie, van boven naar beneden.

13. Voor oppervlakte-bemonstering is het oppervlak waarvan wordt vermoed dat het bacteriën bevat (tafelblad, lichaamsoppervlak, wond) gemarkeerd voor een eenheidsgebied (bijv. 1 cm2), dat wordt gewreven door een gesteriliseerd wattenstaafje. Het wattenstaafje wordt op het oppervlak van de twee weggelaten agarplaten gedrukt.

Streaking wordt aseptisch gedaan door een vlamgesteriliseerde lus. Voor strepen worden bijna parallelle lijnen getrokken door de lus van het aanrakingspunt met wattenstaafje. Deze vormen de primaire strepen. Na vlamsterilisatie van de lus worden secundaire strepen bijna diagonaal getrokken naar de primaire strepen. Op vergelijkbare wijze worden tertiaire en quaternaire strepen aseptisch gemaakt.

14. Vervolgens worden de platen geïncubeerd in omgekeerde positie, van boven naar beneden, bij 37 ° C gedurende 24 uur in de incubator (figuur 6.2).

15. Eén niet-geïnoculeerde agarplaat en één niet-geënte bouillonbuis worden geïncubeerd als controle om juiste sterilisatie te verzekeren zoals aangegeven door geen groei daarin. Deze stap is optioneel.