Recente vooruitgang in Diagnostiek van Malaria

Recente ontwikkelingen in Diagnostiek van Malaria - HL Gupta, VK Talwar, A Rohtagi!

Invoering:

In India is malaria een groot gezondheidsprobleem; er zijn frequente uitbraken geweest in Rajasthan en Noordoost-Staten. In Rajasthan incidentie neemt P. falciparum toe. In Delhi is P. vivax de meest voorkomende soort, maar P. falciparum is ook aangetroffen. Malaria, een wereldwijd probleem, doodt jaarlijks tussen de 1, 5 en 2, 7 miljoen mensen. Met andere woorden het doodt één persoon (vaak een kind <5 jaar) elke 12 seconden. Daarnaast zijn er jaarlijks 300-500 miljoen mensen met de ziekte besmet.

Voor de bestrijding van ziekten is een snelle en nauwkeurige diagnose het belangrijkst. Malaria-diagnose wordt vaak alleen gesteld op basis van klinische symptomen, hoewel de nauwkeurigheid ervan ten hoogste 50 procent is. Nieuwere, geavanceerde diagnostische technieken zijn nu beschikbaar. Recent geïntroduceerde onderzoeken op basis van immunoassay zijn snel (<10 min / test) en minstens even gevoelig als traditionele microscopie.

Light Microscopy: Thick and Thin Blood Smears:

De traditioneel geaccepteerde laboratoriumprocedure voor de diagnose van malaria is microscopisch onderzoek van Giemsa-of Field-gekleurde bloeduitstrijkjes. Idealiter zou bloed moeten worden verkregen door een vingerprik; bloed verkregen door venapunctie en anti-gecoaguleerd (EDTA of heparine) is echter acceptabel als het onmiddellijk wordt onderzocht. Zowel dikke als dunne uitstrijkjes moeten worden gemaakt. Dik uitstrijkje, concentreert rode cellen 20 - 30 keer op een klein oppervlak, verhoogt de gevoeligheid van de techniek en is veel beter dan dunne uitstrijkjes. Dunne uitstrijk is echter specifieker.

Het is de geaccepteerde gouden standaard voor diagnose maar is arbeidsintensief en interpretatie van resultaten vereist aanzienlijke expertise, in het bijzonder met lage parasitemie. Daarnaast kunnen P falciparum-parasieten die vaak worden afgezonderd van perifeer bloed gemakkelijk worden gemist.

Kwantificering van parasieten door onderzoek van bloedvlekken:

Er zijn veel methoden om malaria-parasieten in dikke uitstrijkjes te kwantificeren. Parasietniveaus kunnen ook worden gekwantificeerd door onderzoek van een dunne bloeduitstrijkje. Een groot nadeel van dikke uitstrijkjes is dat het vaak een bepaalde mate van expertise vereist die mogelijk niet beschikbaar is.

Theoretisch moet de onderzoeker dikke-uitstrijkjes tellen die 20 of meer leukocyten / hpf bevatten. In werkelijkheid zijn velden met 20 of meer leukocyten te dik om te tellen, terwijl velden die het gemakkelijkst te lezen zijn die velden die slechts vijf of zes leukocyten / hpf bevatten.

Voorafgaand aan het kleuren moet de onderzoeker in staat zijn om de afdruk te lezen door middel van een goed voorbereid, dik bloeduitstrijkje. Onderzoek van dunne uitstrijkjes is slechts een tiende zo gevoelig als onderzoek van dikke uitstrijkjes. Dus hoewel het onderzoek van bloeduitstrijkjes aanvaardbaar is als de universele 'gouden standaard', is er eigenlijk geen enkele, standaardmethode die door alle onderzoekers wordt gebruikt voor het kwantificeren van parasieten door parasieten in dikke uitstrijkjes te tellen.

Bovendien beperkt het gebrek aan microscopen onder getraind personeel de bruikbaarheid van bloeduitstrijkjes in veel endemische gebieden. Onder erkenning van deze beperkingen zijn alternatieve technieken voor de diagnose van malaria ontwikkeld.

Fluorescerende microscopie:

Drie fluorescente technieken zijn veelbelovend voor de diagnose van malaria.

Dit zijn:

(i) De kwantitatieve buffy-coat (OBC) -methode die beschikbaar is als een commerciële kit

(ii) Het proces van Kawamoto Acridine Orange (AO) en

(iii) Benzothiocarboxypurine (BCP) -procedure.

Deze drie technieken zijn snel en gemakkelijk uit te voeren; wanneer er meer dan 100 parasieten / μL zijn, vertonen ze gevoeligheid en specificiteit die gelijk is aan die welke worden bereikt door dik uitstrijkje.

Zowel OBC- als Kawamoto-methoden gebruiken Acridine Orange (AO) als het fluorochroom om de nucleïnezuren van malariaparasieten in een monster te kleuren. BCP is ook een fluorochroom, dat nucleïnezuren kleurt. AO is niet-specifiek en kleurt nucleïnezuren van alle celtypen.

Bijgevolg moet de onderzoeker leren om met fluorescent gekleurde parasieten te onderscheiden van andere cellen en cellulaire resten. De gevoeligheid van AO-kleuring met parasietniveaus van minder dan 100 parasieten / μL was 41, 7-93 procent.

De specificiteit van AP-kleuring voor P. vivax en P. falciparum is respectievelijk 52 en 93%. BCP-methode heeft een sensitiviteit en specificiteit van meer dan 90 procent. Belangrijke beperking van methoden op basis van AO en BCP is hun onvermogen om onderscheid te maken tussen Plasmodium-soorten. AO is gevaarlijk en vereist speciale vereisten voor verwijdering.

OBC en de BCP zijn technisch veeleisender dan Kawamoto. Kawamoto en AO-methoden vereisen speciale apparatuur en benodigdheden en zijn duurder. De prijs van een fluorescentiemicroscoop zou een beperkende factor kunnen zijn voor laboratoria die geïnteresseerd zijn in het gebruik van deze methoden.

Detecteren van specifieke nucleïnezuursequenties:

Detectie van nucleïnezuursequenties specifiek voor Plasmodium-parasieten kan nuttig zijn. In PCR-gebaseerde technieken wordt de geamplificeerde doelsequentie gedetecteerd door interne probes of geanalyseerd door gelelektroforese. Groot voordeel van het gebruik van een PCR-gebaseerde techniek is het vermogen om een ​​'lage parasitemie te detecteren. Infecties met levende parasieten kunnen met 100% specificiteit worden gedetecteerd.

Dergelijke technieken zijn echter duur en arbeidsintensief, vereisen uitgebreide technische expertise, omvatten meerdere stappen en kunnen niet worden gebruikt om onderscheid te maken tussen levensvatbare en niet-levensvatbare organismen.

PCR-remmers die van nature aanwezig zijn in bloedmonsters kunnen resulteren in een aanzienlijk aantal vals-negatieve resultaten. Valspositieve resultaten, vanwege versleping van de carryover, zijn ook geregistreerd.

PCR-gebaseerde technieken zijn gebruikt om donoren te screenen in een gebied waar malaria endemisch is. De sensitiviteit en specificiteit van PCR-gebaseerde methoden, geschat met behulp van onderzoek van bloeduitstrijkjes als de 'gouden standaard', zijn elk 90 procent of meer.

Bovendien kunnen verdere ontwikkelingen in de PCR-technologie binnenkort haalbare parasieten mogelijk onderscheiden van niet-levensvatbare. Op dit moment wordt het nut van dergelijke technologie beperkt door de behoefte aan dure, gespecialiseerde laboratoriumapparatuur, personeel dat is opgeleid in genetische technologieën en faciliteiten voor 'schone ruimten', en door hoge kosten van gebruikte enzymen en primers.

Antigeendetectie:

Antilichaamdetectietests voor malaria waren beperkt in gevoeligheid en hun vermogen om actieve en eerdere infecties te onderscheiden. De nieuwe generatie antigeen-capture-tests zijn in staat minder parasieten te detecteren en snelle resultaten te produceren (10-15 minuten). Het zijn in de handel verkrijgbare kits, die alle noodzakelijke reagentia bevatten en geen uitgebreide training of uitrusting vereisen.

Er zijn twee parasietantigenen gebruikt in de nieuwe, snelle, diagnostische tests, histidinerijke proteïne-2 (HRP-2), die alleen wordt geproduceerd door P. falciparum en het parasietlactaat-dehydrogenase (pLDH) -antigeen, geproduceerd door alle vier plasmodium soorten die de mens infecteren. Beide antigenen worden in het bloed uitgescheiden door alle aseksuele stadia van de parasiet; het pLDH-antigeen wordt ook geproduceerd door gametocyten.

De nieuwste antigeen-capture tests zijn snel en eenvoudig uit te voeren en hebben detectielimieten vergelijkbaar met die van hoogwaardige microscopie (dwz 100 - 200 parasieten / μL). Wanneer er meer dan 60-100 parasieten / μL zijn, is de HRP- 2 gebaseerde testen zijn zeer (> 90%) gevoelig en (> 90%) specifiek, in vergelijking met dikke uitstrijkmicroscopie.

Momenteel zijn twee van dergelijke tests commercieel verkrijgbaar, de Parasight F-test en de ICT (immunochromatografische) Malaria Pf-test. Beide tests worden uitgevoerd op monsters van de vingerprik en detecteren alleen P. falciparum-malaria.

Ze zijn gebaseerd op monoklonale antilichamen tegen HRP-2, die geïmmobiliseerd zijn op nitrocellulosestroken om dompelstokken of kartontests te produceren (ICT Pf Test). Bij elke test wordt een positief resultaat aangegeven door het verschijnen van een rode lijn op de teststrip, waarbij de monoklonale antilichamen geïmmobiliseerd zijn.

Beide tests bevatten ook een ingebouwde controle; er moet een controlelijn verschijnen om een ​​test als geldig te beschouwen. De gevoeligheid en specificiteit van de Parasight F-test zijn respectievelijk 88 en 97 procent, vergelijkbaar met PCR.

Hoewel op HRP-2 gebaseerde serologische tests een snelle diagnose van falciparum-malaria hebben toegestaan, hebben ze een beperkte bruikbaarheid. Omdat HRP-2 alleen aanwezig is in P. falciparum, zijn tests op basis van de detectie van HRP-2 negatief bij infecties veroorzaakt door vivax, ovale of malaria.

Veel gevallen van niet-falciparum-malaria zullen daarom verkeerd gediagnosticeerd worden als malaria-negatief. Een andere beperking van op HRP-2 gebaseerde tests is dat HRP-2 in bloed blijft bestaan ​​nadat de klinische symptomen verdwenen zijn en de parasieten blijkbaar uit de gastheer zijn verdwenen.

In feite is HRP-2 ontdekt in mummies. Tests voor dit antigeen kunnen daarom niet nuttig zijn voor het screenen van mensen die inheems zijn in endemische gebieden, die mogelijk een persistente parasitemie op laag niveau hebben. De mogelijke reden voor persistentie van HRP-2-antigeen is niet goed begrepen; het kan de aanwezigheid van latente, levensvatbare parasieten (mogelijk een gevolg van falen van de behandeling) of van oplosbare antigeen-antilichaamcomplexen weerspiegelen.

De persistentie kan ook afhankelijk zijn van het ingestelde anti-malariaprogramma. Het HRP-2-signaal kan 19 dagen aanhouden na blijkbaar effectieve kinine- en doxycycline-therapie. Ook persisterende HRP-2-antigeenemie werd waargenomen tijdens en na artemether-therapie.

Andere beperkingen hebben specifiek betrekking op technische aspecten van het HRP-2-systeem. Monoklonaal IgG dat wordt gebruikt in het Parasight F-systeem kan bijvoorbeeld kruisreageren met reumafactor en een vals-positieve reactie veroorzaken.

De ICT Pf-test maakt gebruik van een monoklonaal IgM, dat niet kruisreageert en er zijn geen meldingen van vals-positieve reacties bij deze test vanwege de reumafactor. De ICT Pf-test vereist echter opslag bij 4 ° C, wat het nut ervan onder veldsituaties beperkt.

op pLDH gebaseerde serologische testen:

De nieuwste snelle serologische tests voor de diagnose van malaria zijn gebaseerd op de detectie van pLDH. Net als op HRP-2 gebaseerde tests zijn deze tests gevoelig, specifiek en gemakkelijk uit te voeren, met resultaten die in minder dan 15 minuten verkrijgbaar zijn.

De op pLDH gebaseerde assays zijn ook in staat onderscheid te maken tussen P. falciparum en andere Plasmodium-soorten en omdat pLDH alleen door levensvatbare parasieten wordt geproduceerd, zijn ze ook bruikbaar bij het volgen van anti-malaria-therapie. pLDH van P. falciparum is gedifferentieerd van gastheer LDH (h-LDH) met 3-acetylpyridine adenine dinucleotide (APAD), een analoog van Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD).

De op pLDH gebaseerde testen zijn beschikbaar in twee vormen, een semi-kwantitatieve, droge, peilstok (OptiMAL); en een kwantitatieve, immuno-enzymatische capture-assay. De OptiMAL-test maakt gebruik van twee monoklonale antilichamen, één specifiek voor P. falciparum en de andere die alle 4 Plasmodia herkent.

Het geteste bloedmonster (10 μl vingerprik, volbloed of bevroren hemolysaat) wordt gemengd met 3oμL, lyseringsbuffer die geconjugeerd monoklonaal antilichaam bevat. Dit mengsel laat men in de OptiMAL, peilstok, weken.

Na 3 minuten wordt 100 ui bufferbuffer toegevoegd. Als P. falciparum in het bloedmonster aanwezig is, ontwikkelen zich drie lijnen (waaronder één, aan de bovenkant van elke staaf, die de positieve controle voorstelt) op peilstokjes.

Twee lijnen duiden P. vivax, P. malariae of af en toe, P. ovale aan. Een nieuw geformatteerde OptiMAL-2 strip heeft drie testlijnen en een positieve controlelijn, waardoor alle vier de Plasmodium-soorten kunnen worden geïdentificeerd.

Elke test wordt alleen als ongeldig beschouwd als de controlelijn zich ontwikkelt. De monoklonale antilichamen die worden gebruikt in de OptiMAL-test zijn uitvoerig getest op kruisreactiviteit met LDH van leishmania, babesia en pathogene bacteriën of schimmels en er is geen bewijs van dergelijke kruisreactiviteit gevonden.

HRP-2 bleek goed aan te houden nadat perifere parasitemie was verdwenen. Hoewel de pLDH-niveaus de perifere parasitemie op de voet volgen en 3-5 dagen na de behandeling met kinine en doxycycline tot ondetecteerbare waarden daalden, daalden de niveaus van HRP-2-antigeen pas na 19 dagen, lang nadat de patiënt symptoom is en blijkbaar parasitevrij.

OptiMAL-assay zou daarom een ​​waardevol hulpmiddel moeten zijn bij het controleren van anti-malaria therapie. De klaring van parasitemie en de klaring van pLDH lijken parallel te lopen.

OptiMAL-testen, is zeer veelzijdig. De OptiMAL-test heeft gevoeligheden van respectievelijk 94 - 88 procent en specificiteit van 100 en 99 procent voor P. vivax en P. falciparum, in vergelijking met bloeduitstrijkjes.

Deze test kan worden gebruikt als een epidemiologisch hulpmiddel, omdat in gebieden waar meer dan één soort van Plasmodium circuleert, het kan worden gebruikt om de Plasmodium-soort te identificeren die patiënten in elk dorp snel infecteert en werknemers in de volksgezondheid de best passende chemotherapie kan geven .

conclusies:

In de afgelopen jaren hebben pogingen om de traditionele en vervelende lezing van bloeduitstrijkjes (een methode die bijna 100 jaar geleden is ontwikkeld) te vervangen, geleid tot technieken voor de detectie van malariaparasieten die gevoeligheden opleveren die gelijk zijn aan of beter dan microscopie.

Hoewel op PCR gebaseerde methoden aantoonbaar het gevoeligst zijn, zijn ze zo duur en hebben ze zulke gespecialiseerde apparatuur en training nodig dat ze waarschijnlijk niet worden gebruikt voor routinematige diagnose in de meeste ontwikkelingslanden.

Ze zijn bijzonder nuttig voor studies over stamverschillen, mutaties en genen die betrokken zijn bij resistentie tegen geneesmiddelen in de parasiet, en voor het aantonen van de mate van verwantschap tussen stammen geassocieerd met verschillende uitbraken van malaria. De meest veelbelovende, nieuwe malariodiagnostiek zijn de serologische peilstoktests.

Deze tests, waaronder ParaSight F, ICT Pf Test en OptiMAL, zijn eenvoudig te gebruiken, gemakkelijk te interpreteren en produceren resultaten binnen 15 minuten of minder. Deze testen zijn bijna net zo gevoelig als microscopisch onderzoek van bloeduitstrijkjes, maar vereisen geen hooggeschoold personeel om resultaten uit te voeren of te interpreteren.

De OptiMAL-test heeft de extra voordelen om alle vier de plaspiodium-soorten te kunnen detecteren en de werkzaamheid van medicamenteuze therapie te volgen, omdat het een enzym meet dat alleen door levende parasieten wordt geproduceerd.

Hoewel de dipstick-tests twee duidelijke beperkingen hebben, mag ook niet worden voorkomen dat deze tests algemeen worden geaccepteerd. De eerste beperking is die van gevoeligheid. De drie momenteel op de markt gebrachte testen hebben gevoeligheidsdrempels van 50-100 parasieten / μl. De gevoeligheid voor monsters met <50 parasieten / μL is consistent 50% -70%.

Dit niveau van gevoeligheid is misschien niet zo'n groot probleem voor mensen die permanent in endemische gebieden wonen, die vaak geen behandeling krijgen tenzij ze meer dan 500 parasieten / μL bloed hebben, maar een probleem kunnen vormen bij de diagnose van malaria bij die personen die komen uit niet-endemische gebieden maar leven, werken of reizen in endemisch gebied.

Aangezien de overgrote meerderheid van de malariapatiënten niveaus van parasieten hebben die ver boven de 50 parasieten / μL liggen, zouden echter een paar patiënten een verkeerde diagnose krijgen als de peilstoktests routinematig zouden worden gebruikt. De tweede beperking van dergelijke tests, althans op dit moment, is hun prijs.

De Wereldgezondheidsorganisatie is van mening dat diagnostische tests voor malaria, voor mensen in endemische gebieden, voordeel zouden moeten hebben van minder dan US $ 0, 40 per monster. Tenzij de peilstoktests massaal worden geproduceerd, is deze prijs onbereikbaar en niet praktisch voor fabrikanten om elkaar te ontmoeten.

De huidige kosten van de peilstoktesten zijn afhankelijk van de locatie van de koper en het bestelde volume. De kosten van de ICT Pf Tests variëren bijvoorbeeld van US $ 1, 30 / test in ontwikkelingslanden. De Para 0Sight F-tests worden verkocht voor US $ 1, 20 / test. De optiMAL-strip verkoopt momenteel voor US $ 3, 00 / test.