Redenen en methodologieën voor genoomsequencing

Het sequencen van genomen is geavanceerd, complex en vereist gespecialiseerde technologie. Van een segment van 500-800 bp kan de sequentie worden bepaald. De genomen zijn echter erg groot, bijvoorbeeld E. coli met 4, 2 x 10 6 bp en 3, 2 x 10 9 bp voor mensen.

Dus voor het sequencen zijn kleine segmenten nodig. Dergelijke segmenten worden geproduceerd door willekeurig genomisch DNA in kleine fragmenten te breken. Dergelijke fragmenten overlappen gewoonlijk andere fragmenten aan hun uiteinden. Fragmenten worden in een vector gekloneerd om een ​​genomische bibliotheek van organisme te genereren.

Redenen voor het volledig sequencen van een genoom:

(i) Het verschaft informatie als basis voor de ontdekking van genen en verschaft een inventaris van genen.

(ii) Het vertegenwoordigt de mogelijke relaties tussen de genen.

(iii) Sequentiebepaling van genomen levert een reeks hulpmiddelen voor verder experimenteren.

(iv) Genetische informatie van een organisme wordt beschikbaar gemaakt vanuit de gensequentie.

(v) Volledige genetische sequentiebepaling van een organisme levert alle genetische informatie die nodig is om een ​​organisme te vormen.

Gebruikte methodes voor genoomsequencing:

(i) Gerichte sequencing van Bacterial Artificial Chromosome (BAC) contigs:

Bacteriële kunstmatige chromosomen zijn eenvoudigweg plasmiden die zijn ontworpen voor het klonen van zeer lange segmenten (dwz 100.000 tot 300.000 bp) DNA. Deze vectoren worden gebruikt om genomische bibliotheken te maken waarin de inslaggrootte 80 - 100 kb is. DNA-fragmenten van duizenden basenparen worden in de BAC-vector gekloneerd.

De genomische bibliotheek wordt gescreend door het lokaliseren van algemene restrictieklonen die contigs worden genoemd. De leden van contig bevatten enkele overlappende gebieden om de precieze bepaling van hun locatie in contig mogelijk te maken.

Het uiteindelijke doel van fysieke mappingmethoden is om een ​​volledige contig voor elk chromosoom van het genoom te ontvangen. De in kaart gebrachte contigs worden gesequenced door grote DNA-fragmenten in kleine segmenten te breken. Van elke kloon van de contig wordt de sequentie bepaald. De nucleotidesequentie wordt alleen op basis van kloon geïdentificeerd totdat de sequentie van het complete genoom is bepaald.

(ii) Willekeurige shotgunsequencing of Bottom-up benadering:

Het is mogelijk om in één organisme elk gewenst gen van een ander organisme te kloonen door middel van shotgunning. Want dit gehele genoom van het eerste organisme wordt gedigereerd met restrictie-endonuclease om een ​​willekeurig mengsel van fragmenten te produceren.

Willekeurige (shotgim) bibliotheken van genomisch DNA worden geconstrueerd in kleine ie 2, 0 kb en medium dwz 10 kb insert plasmidevectoren samen met genomische shotgun grote insert BAC bibliotheek (80-100 kb). Fragmenten worden ingevoegd in de plasmidevector en de recombinante plasmiden worden getransformeerd in de gewenste gastheercel.

Bij shot-gunsequencing worden willekeurig geselecteerde klonen gesequenced totdat klonen in de genoombibliotheek worden geanalyseerd. Met andere woorden, we kunnen zeggen dat bij random shot gun-sequencing chromosomen in secties worden verdeeld en vervolgens de coupe van genomisch DNA wordt opgedeeld in miljoenen kleine segmenten en alle segmenten op een onbevooroordeelde manier worden gesequenced.

Gebieden van overlappend DNA worden gematcht, die grotere en grotere segmenten van genomisch DNA vormen. DNA-sequentiebepaling wordt uitgevoerd aan beide uiteinden van inserties van willekeurig geselecteerde klonen van zowel de kleine als de medium-insertieplasmidebibliotheken om ten minste drie maal dekking van het genoom te verschaffen.

Kleine DNA-fragmenten worden willekeurig in verschillende plasmidemolecu- len ingevoegd. In het geval van overlappende invoegingen, komen ze allemaal van dezelfde genomische locatie, maar van verschillende regio's verschoven naar links of naar rechts ten opzichte van elkaar.

De overlappende fragmenten worden uitgelijnd in coting of in een reeks voor het betreffende gebied (shot gun-methode). Prokaryote genomen hebben weinig respectieve DNA en de volgordebepaling met schot kan goede resultaten opleveren. Eukaryoten dragen veel herhaalde sequenties.

Dit alles leidt tot verwarring. Overlap van fragmenten wordt echter in de assembleringsfase benut door middel van computationele oefening. Computerprogramma identificeert de overlappende sequenties en verbindt ze tot één doorlopende stuk. Dit proces is met succes toegepast voor het sequeneren van alle microbiële genoomsequenties gepubliceerd door Celera Genomics.