Oxidase-test op bacteriën om hun vermogen om oxidatie verminderd cytochroom C te oxideren te achterhalen

Lees dit artikel om meer te weten te komen over de oxidase-test op bacteriën om hun vermogen om geoxideerd cytochroom C te oxideren te achterhalen:

Beginsel:

Sommige bacteriën hebben het vermogen om 'verminderd cytochroom C' in hun cellen te oxideren tot 'geoxideerd cytochroom C', omdat ze het enzym 'cytochrome oxidase' kunnen produceren.

Het geoxideerde cytochroom C produceert een paarse kleur (paars van Wurster) met de kleurstof N-tetramethyl-para-fenyleendiamine (dwz oxidase-reagens).

In de oxidase-test worden voedingsagar-agarplaten die de kolonies van de testbacteriën bevatten overstroomd met de oplossing van oxidase-reagens. Als de bacteriën het vermogen hebben om het enzym cytochroomoxidase te produceren, verandert de kleur van de kolonies op de platen in paars. Als de bacteriën niet het vermogen hebben om cytochroomoxidase te produceren, behouden de koloniën de oorspronkelijke roze kleur van het oxidase-reagens.

Vereiste materialen:

Petrischalen, erlenmeyer, wattenstaafjes, platina draad inentende lus, autoclaaf, bunsenbrander, laminaire stromingskamer, wegwerpkruik, incubator, Whatman filterpapierstrip, oxidase-reagens (N-tetramethyl-para-fenyleendiamine) voedingsagar, geïsoleerde kolonies of zuivere culturen van bacteriën.

Procedure:

(a) Plaatmethode:

1. Twee petrischalen worden gereinigd, afgedekt met handgeschept papier en met draad of rubberen band vastgemaakt (figuur 7.19). Deze stappen evenals de sterilisatie van de petrischalen bij stap 6 zijn weggelaten, indien ovengesteriliseerde petrischalen direct worden gebruikt.

2. De ingrediënten van voedingsagarmedium of het kant-en-klare poeder dat voor 100 ml van het medium is vereist, worden gewogen en opgelost in 100 ml gedestilleerd water in een erlenmeyer van 250 ml door schudden en zwenken.

3. De pH wordt bepaald met behulp van een pH-papier of pH-meter en bijgesteld tot 7, 0 met 0, 1 N HCI als het meer is of met 0, 1 N NaOH als dit minder is.

4. De kolf wordt verwarmd om de agar volledig in het medium op te lossen.

5. De fles is van katoenstof voorzien, bedekt met kraftpapier en met draad of rubberen band vastgemaakt.

6. De twee petrischalen en de erlenmeyer bevattende voedingsagarmedium worden gedurende 15 minuten gesteriliseerd bij 121 ° C (15 psi druk) in een autoclaaf.

7. Na sterilisatie worden ze uit de autoclaaf verwijderd en kunnen ze enige tijd afkoelen zonder het medium te laten stollen. Koeling van het medium voorkomt condensatie en ophoping van waterdruppeltjes in de platen. Als het medium al tijdens opslag is bereid en gestold, moet het vloeibaar worden gemaakt door het voorzichtig te verhitten totdat het volledig is gesmolten.

8. Om voedingsagarplaten te bereiden, voordat het gesteriliseerde voedingsagarmedium afkoelt en stolt, wordt het in warme gesmolten toestand aseptisch gegoten, bij voorkeur in een laminaire stromingskamer, in de twee gesteriliseerde petrischalen (elk ongeveer 20 ml), zodat het gesmolten medium bedekt de bodem van de petrischalen volledig.

Vervolgens worden de platen bedekt met hun deksels en men laat ze afkoelen om het medium daarin te laten stollen. Waterdamp die kan condense- ren op het binnenoppervlak van de platen en deksels wordt verdampt door de platen en de deksels in omgekeerde positie te houden in een incubator bij 37 ° C gedurende ongeveer 1 uur.

9. Elke plaat is aan de onderkant gemarkeerd in vier kwartieren.

10. "Vlek inoculatie" van de testbacteriën wordt aseptisch gedaan, bij voorkeur in een laminaire stroomkamer, in het midden van elk kwart door een vlek (of klein uitstrijkje) van de bacteriën te maken met behulp van een vlamgesteriliseerde lus. De lus wordt gesteriliseerd na elke inoculatie.

11. De geënte platen worden geïncubeerd in omgekeerde positie, top-down, bij 37 ° C gedurende 24 uur in een incubator totdat kolonies van de bacteriën zichtbaar zijn.

12. De platen worden overstroomd met oxidase-reagens.

(b) Papiermethode:

1. Een Whatman filtreerpapierstrip, gedipt in 1% oxidase-reagens wordt gedroogd en in het donker bewaard.

2. Vóór gebruik wordt het bevochtigd en wordt er een lus van de testbacteriën op aangebracht als een vlek met behulp van een platinadraadlus. Nichrome-lus kan het reagens oxideren. Daarom moet de platinalus worden gebruikt.

3. De vlek wordt na 10 seconden waargenomen.