Ortho-Nitrofenyl Galactoside-test op bacteriën om hun vermogen tot hydrolyse te vinden Ortho-Nitrofenyl-PD-Galactoside

Lees dit artikel om meer te weten te komen over de prestaties van Ortho-Nitrophenyl Galactoside Test op bacteriën om hun vermogen tot hydrolyse van Ortho-Nitrofenyl-PD-Galactoside te vinden!

Beginsel:

Sommige bacteriën hebben het vermogen om lactose te fermenteren. Ze worden 'lactose-fermenterende bacteriën' of 'lactose-fomentoren' genoemd.

De andere, die lactose niet kunnen fermenteren, worden lactose-niet-fermenterende bacteriën 'of' lactose-non-fomenters 'genoemd.

De lactose-fermenterende bacteriën kunnen twee enzymen produceren, namelijk 'permease' en 'β-galactosidase', die betrokken zijn bij de fermentatie van lactose. Permease helpt bij de intrede van lactose in de bacteriecellen, terwijl β-galactosidase lactose hydrolyseert tot glucose en galactose, is β-galactosidase een intracellulair induceerbaar enzym, waarvan de productie wordt geïnduceerd door de aanwezigheid van lactose in de omgeving van de bacteriecellen.

Hoewel lactose-fermenterende bacteriën zowel permease als β-galactosidase kunnen produceren, kunnen lactose-niet-fermenterende bacteriën geen permease produceren, maar kunnen ze wel of niet β-galactosidase produceren. De ONPG-test wordt uitgevoerd om het vermogen van lactose-niet-fermenterende bacteriën om P-galactosidase te produceren, te achterhalen.

Hiervoor wordt het celmembraan van de lactose-niet-fermenterende bacteriecellen opgelost door tolueen toe te voegen, om alle intracellulaire enzymen inclusief P-galactosidase, indien aanwezig, af te geven. Het enzym, ß-galactosidase, hydrolyseert het substraat ortho-nitrofenyl-β-D-galctoside (ONPG) naar ortho-nitrofenol, dat geel van kleur is.

Bij de ortho-nitrofenylgalactosidetest (ONPG-test) worden de testbacteriën gekweekt op drysuikerijzeragar (TSI-agar) -hellingen, die lactose bevatten. Als de bacteriën een niet-gefermenteerde lactose zijn, zoals aangegeven door rode kont en rode helling, wordt een dikke suspensie van de bacteriën gemaakt in zoutoplossing, waaraan tolueen wordt toegevoegd gevolgd door een ONPG-oplossing. Als de bacterie het vermogen heeft om het enzym P-galactosidase te produceren, verandert de kleur van de bacteriesuspensie in geel.

Vereiste materialen:

Testbuizen, erlenmeyer, wattenstaafjes, entdraad, entdraad, autoclaaf, bunsenbrander, laminaire stromingskamer, wegruimpot, incubator, TSI-agar, tolueen, o-nitrofenyl-β-D-galactoside (ONPG) -oplossing, geïsoleerde kolonies of zuivere culturen van bacteriën.

Procedure:

1. De ingrediënten van TSI-agarmedium (bevattende de 3 suikers en ijzer als de hoofdcomponenten) of het kant-en-klare poeder dat voor 100 ml medium is vereist, worden gewogen en opgelost in 100 ml gedestilleerd water in een erlenmeyer van 250 ml met schudden en wervelen (figuur 7.16).

2. De pH wordt bepaald met behulp van een pH-papier of pH-meter en bijgesteld tot 7, 4 met behulp van 0, 1 N HCI als het meer is of met 0, 1 N NaOH als dit minder is.

3. De kolf wordt verwarmd om de agar volledig in het medium op te lossen.

4. Voordat het stolt, wordt het medium in warme gesmolten toestand verdeeld in 5 reageerbuizen (elk ongeveer 20 ml).

5. De reageerbuisjes zijn van katoenstof voorzien, afgedekt met kraftpapier en met draad of rubberen band verbonden.

6. Ze worden gedurende 15 minuten bij 121 ° C (15 psi druk) gesteriliseerd in een autoclaaf.

7. Na sterilisatie worden ze uit de autoclaaf verwijderd en in een schuine positie gehouden om het medium af te koelen en te laten stollen, zodat de TSI-agarhellingen worden verkregen.

8. De testbacteriën worden aseptisch geënt, bij voorkeur in een laminaire stromingskamer, in de hellingen door steken in de kolf en strepen op het oppervlak van de hellingen met behulp van een met vlam gesteriliseerde naald. De naald wordt na elke inoculatie gesteriliseerd.

9. De geënte hellingen worden 24 uur geïncubeerd bij 37 ° C in een incubator.

10. Als de bacterie een lactose-fermentor is, is deze niet geselecteerd voor de ONPG-test. Als de bacterie lactose-niet-fermenterend is, zoals aangegeven door rode kont en rode helling, wordt deze geselecteerd voor de ONPG-test.

11. Aan een reageerbuis die 0, 25 ml zoutoplossing bevat, wordt een dikke kweek van de bacteriën aangebracht door middel van een met vlam gesteriliseerde lus, om een dikke suspensie van de bacteriën te maken.

12. Eén druppel tolueen wordt toegevoegd, gemengd en gedurende 5 minuten bij 37 ° C geïncubeerd.

13. O-nitrofenylgalactoside-oplossing (ONPG-oplossing) wordt toegevoegd en gedurende 30 minuten bij 37 ° C geïncubeerd. Vervolgens wordt de kleurverandering waargenomen. Opnieuw wordt kleurverandering waargenomen na 24 uur.