Experiment om Colipaag van een Virus te isoleren (met diagram)

Experiment om Colipaag van een Virus te isoleren!

Beginsel:

De bacteriofaag of faag (virus) die de bacteriën infecteert, Escherichia coli wordt colifaag (coli: E. coli, faag: bacteriofaag) genoemd.

Het kan worden verkregen uit een verscheidenheid aan natuurlijke bronnen, zoals bodem, ontlasting en ongezuiverd rioolwater. Zijn isolatie van deze bronnen is niet erg gemakkelijk, omdat het aanwezig is in een lage concentratie.

Daarom wordt eerst het aantal ervan verhoogd door een verrijkingsstap, waarin een rijke kweek van de gastheerbacterie (dwz E. coli) wordt toegevoegd aan het colifaagbevattende monster en geïncubeerd. De colipaag infecteert E. coli en neemt in aantal sterk toe. Deze colifaagrijke kweek wordt gecentrifugeerd om het deeltjesvormige materiaal te bezinken.

Het sediment wordt weggegooid en het supernatant wordt gefilterd door een microbieel filter om bacteriën en andere deeltjes tegen te houden, terwijl de colifaag doorlaat. Het filtraat, rijk aan colifaag, wordt gebruikt om een ​​suspensie van E. coli te zaaien, die vervolgens als een confluent gazon op een agarplaat kan groeien.

De coliphage groeit in de E. coli-cellen en lyseert ze. Lysis van de bacteriecellen resulteert in de vorming van heldere zones op het samenvloeiende gazon van bacteriën. Deze vrije zones worden plaques genoemd. Elke vrije zone wordt verondersteld gevormd te zijn door een enkele colipaag.

Vereiste materialen:

Pipetten, erlenmeyers, petrischalen, reageerbuisjes, wattenstoppen, bunsenbrander, wegwerpkruik, centrifuge, membraanfiltratieapparaat, laminaire stromingskamer, autoclaaf, incubator, bacteriofaag bouillon, trypton zachte agar, trypton harde agar, voedingsbodem cultuur van de bacteriën Escherichia coli (bijv. E. coli B), monster (bijv. ongezuiverd rioolwater).

Procedure:

1. Vijf pipetten (in een roestvrijstalen pipetkoker) en vijf petrischalen worden gedurende 3 uur gesteriliseerd in een heteluchtoven op 180 ° C. Als alternatief kunnen ze worden afgedekt met handgeschept papier, verbonden met een draad of rubberen band en gesteriliseerd in een autoclaaf samen met de media (figuur 8.5).

2. De ingrediënten van het bacteriofaagkweekmedium of het kant-en-klare poeder ervan, benodigd voor 100 ml medium, worden gewogen, opgelost in 100 ml gedestilleerd water in een erlenmeyer van 250 ml en de pH op 7, 6 ingesteld. De fles is van katoen, verstopt, bedekt met handgeschept papier en vastgemaakt met draad of rubberen band.

3. De ingrediënten van trypton zacht agarmedium of het kant-en-klare poeder daarvan, vereist voor 100 ml medium, worden afgewogen, opgelost in 100 ml gedestilleerd water in een erlenmeyer van 250 ml en de pH wordt ingesteld op 7, 5.

4. Dit vloeibare medium wordt verdeeld in 5 reageerbuizen (elk 2 ml), met katoen bedekt, bedekt met ambachtelijk papier en met draad of rubberen band vastgemaakt.

5. De ingrediënten van trypton hard agarmedium of het kant-en-klare poeder dat vereist is voor 100 ml medium worden afgewogen en opgelost in 100 ml gedestilleerd water in een erlenmeyer van 250 ml door verwarming na pH-bijstelling tot 7, 5. De fles is van katoen, verstopt, bedekt met handgeschept papier en vastgemaakt met draad of rubberen band.

6. De kolf met bacteriofaagvloeistof, de 5 trypton-zachte agarbuizen, de kolf die trypton-harde agarmedium en een lege conische kolf van 250 ml bevat, worden gedurende 15 minuten bij 121 ° C (15 psi-druk) in een autoclaaf gesteriliseerd.

7. Het gesteriliseerde trypton harde agarmedium in de erlenmeyer wordt aseptisch in de 5 gesteriliseerde petrischalen gegoten en toegestaan ​​af te koelen, om 5 trypton-harde agarplaten te krijgen.

8. In de met katoen verstopte gesteriliseerde lege erlenmeyer van 250 ml worden 5 ml gesteriliseerde bacteriofaagvloeistof, 5 ml E. coli B-kweek en 45 ml ruw afvalwater aseptisch overgebracht, bij voorkeur in een laminaire stromingskamer (Figuur 8.6). .

9. De kolf wordt gedurende 24 uur bij 37 ° C geïncubeerd, zodat de colipaag in het rioolwater kan prolifereren in de gastheer-bacteriecellen (cellen van E. coli B).

10. De inhoud van de kolf wordt in centrifugebuizen van 100 ml gegoten en gedurende 20 minuten bij 2500 tpm in een centrifuge gecentrifugeerd om de deeltjes te bezinken. Het sediment wordt weggegooid.

11. Het supernatant, rijk aan colifaag, wordt door een membraanfiltratie-inrichting gefiltreerd. Het residu wordt weggegooid.

12. De vijf gesteriliseerde trypton zachte agarbuizen worden genomen en verwarmd op een waterbad tot 100 ° C, om de agar te smelten. De buizen worden afgekoeld en op 45 ° C op een waterbad gehouden.

13. Met behulp van een steriele pipet worden 1, 2, 3, 4 en 5 druppels van het bacterievrije filtraat, rijk aan colipaag, aseptisch overgebracht naar de vijf trypton-zachte agarbuizen.

14. Aan elke trypton-zachte agarbuis wordt 0, 1 ml van een voedingsbodemcultuur van Escherichia coli B aseptisch overgebracht.

15. De inhoud van de vijf trypton-zachte agar-buizen met het virus, colifaag en de bacteriën, E. coli B, worden snel gemengd door de buizen tussen de handpalmen te draaien.

16. De inhoud wordt gegoten over de vijf trypton-harde agarplaten (gemerkt met 1 tot 5 druppels), waardoor een dubbellaagse plaatcultuurbereiding wordt gevormd. De platen worden zachtjes gewerveld en kunnen uitharden.

17. De geënte platen worden geïncubeerd in een omgekeerde positie bij 37 ° C gedurende 24 uur in een incubator.

opmerkingen:

1. Alle platen worden geobserveerd voor plaquevormende eenheden (PFU's) die zich ontwikkelen als heldere zones op het gazon van bacteriën. Plaquevorming is een aanwijzing voor de aanwezigheid van colifaag in de kweek.

2. Elke plaque vertegenwoordigt een rijke groei van geïsoleerde coliphage.

3. Het aantal plaques wordt geteld in alle platen en getabelleerd als volgt (tabel 8.1).

Tabel 8.1: Waarnemingen van het aantal colibiës :