Deoxyribonuclease Test op bacteriën om hun vermogen om DNA te hydrolyseren (met figuur) te achterhalen

Deoxyribonuclease-test (DNase-test) op bacteriën om hun vermogen om DNA te hydrolyseren (met figuur) te achterhalen!

Beginsel:

Sommige bacteriën hebben het vermogen om desoxyribonucleïnezuur (DNA) te hydrolyseren tot oligonucleotiden, omdat ze het extracellulaire hydrolytische enzym 'deoxyribonuclease' (DNase) kunnen produceren.

Terwijl het DNA wordt geprecipiteerd door zoutzuur producerende opaciteit, worden de gehydrolyseerde eindproducten ervan, oligonucleotiden, niet geprecipiteerd door zoutzuur, waarvoor ze niet zo'n opaciteit produceren; produceer liever transparantie.

In de DNase-test worden de testbacteriën gekweekt op agarplaten die DNA bevatten. Nadat de kolonies van de bacteriën zichtbaar zijn, worden de platen overstroomd met zoutzuur. Als de bacteriën het vermogen hebben om DNA te hydrolyseren, hydrolyseren de kolonies het DNA in het medium in de gebieden die hen omringen, terwijl de rest van de gebieden van de platen niet-gehydrolyseerd DNA bevatten.

Dientengevolge, wanneer overstroomd met zoutzuur, worden transparante heldere zones rond de kolonies gevormd, omdat de gehydrolyseerde producten, oligonucleotiden, die daaromheen worden gevormd, geen precipitaten vormen met het zoutzuur.

Aan de andere kant worden de rest van de gebieden van de platen ondoorzichtig, omdat het niet-gehydrolyseerde DNA in deze gebieden precipitaten vormt met het zoutzuur. Als toluïdineblauw wordt gebruikt in plaats van zoutzuur, wordt alleen rond de kolonies een roze roze halo geproduceerd.

Vereiste materialen:

Petrischaaltjes, erlenmeyer, wattenstaafjes, entdraad, autoclaaf, bunsenbrander, laminaire stromingskamer, wegwerppot, incubator, DNase agar, IN zoutzuur (of 0, 1% toluidine blauw), geïsoleerde kolonies of zuivere culturen van bacteriën.

Procedure:

1. Twee petrischalen worden gereinigd, afgedekt met handgeschept papier en met draad of rubberen band vastgemaakt (Figuur 7.23). Deze stap evenals de sterilisatie van de petrischalen bij stap 6 zijn weggelaten, indien ovengesteriliseerde petrischalen direct worden gebruikt.

2. De ingrediënten van DNase-agarmedium (dat DNA als de hoofdcomponent bevat) of het kant-en-klaar poeder ervan dat voor 100 ml medium nodig is, worden afgewogen en opgelost in 100 ml gedestilleerd water in een erlenmeyer van 250 ml door schudden en zwenken.

3. De pH wordt bepaald met behulp van een pH-papier of pH-meter en bijgesteld tot 7, 2 met 0, 1 N HCI als het meer is of met 0, 1 N NaOH als dit minder is.

4. De kolf wordt verwarmd om de agar volledig in het medium op te lossen.

5. De fles is van katoenstof voorzien, bedekt met kraftpapier en met draad of rubberen band vastgemaakt.

6. De twee petrischalen en de erlenmeyer bevattende DNase agarmedium worden 15 minuten bij 121 ° C (15 psi druk) gesteriliseerd in een autoclaaf.

7. Na sterilisatie worden ze uit de autoclaaf verwijderd en kunnen ze enige tijd afkoelen zonder het medium te laten stollen. Koeling van het medium voorkomt condensatie en ophoping van waterdruppeltjes in de platen. Als het medium al tijdens opslag is bereid en gestold, moet het vloeibaar worden gemaakt door het voorzichtig te verhitten totdat het volledig is gesmolten.

8. Om DNase-agarplaten te bereiden, voordat het gesteriliseerde DNase-agarmedium afkoelt en stolt, in warme gesmolten toestand, wordt het aseptisch gegoten, bij voorkeur in een laminaire stromingskamer, in de twee gesteriliseerde petrischalen (elk ongeveer 20 ml), zodat het gesmolten medium bedekt de bodem van de petrischalen volledig.

Vervolgens worden de platen bedekt met hun deksels en men laat ze afkoelen om het medium daarin te laten stollen. Waterdamp die kan condense- ren op het binnenoppervlak van de platen en deksels wordt verdampt door de platen en de deksels in omgekeerde positie te houden in een incubator bij 37 ° C gedurende ongeveer 1 uur.

9. Elke plaat is aan de onderkant gemarkeerd in vier kwartieren.

10. "Vlek inoculatie" van de testbacteriën wordt aseptisch gedaan, bij voorkeur in een laminaire stroomkamer, in het midden van elk kwart door een vlek (of klein uitstrijkje) van de bacteriën te maken met behulp van een vlamgesteriliseerde lus. De lus wordt gesteriliseerd na elke inoculatie.

11. De geënte platen worden geïncubeerd in omgekeerde positie, van bovenaf, bij 37 ° C gedurende 24 tot 48 uur in een incubator totdat kolonies van de bacteriën zichtbaar zijn.

12. De platen worden overstroomd met een oplossing van 1 N zoutzuur (of 0, 1% toluïdineblauw).