Streef ernaar verschillende bacteriën in een gegeven monster te isoleren en hun zuivere culturen te behouden

Probeer verschillende bacteriën in een bepaald monster te isoleren en hun zuivere culturen te behouden.

Doel:

Bacteriën die in de natuur worden aangetroffen, komen niet voor als gescheiden soorten, maar komen eerder voor als gemengde populaties van verschillende soorten.

Daarom, om de individuele soorten bacteriën te bestuderen, is het eerst nodig om ze te scheiden van de gemengde populatie. Dit proces wordt 'isolatie van bacteriën' genoemd.

Het wordt bereikt door de gemengde populatie van bacteriën op het oppervlak van een vast medium te laten groeien in afzonderlijke kolonies. 'Kolonies' zijn individuele macroscopisch zichtbare massa's bacteriën die groeien op het oppervlak van een vast medium, die elk de vermenigvuldiging van een enkele bacterie voorstellen.

Omdat elke kolonie voortkomt uit de groei en herhaalde vermenigvuldiging van een enkele bacterie, behoren alle in de kolonie aanwezige bacteriën tot dezelfde soort. Elke kolonie vertegenwoordigt dus een zeer grote populatie van een enkele bacteriesoort.

Deze kolonies worden aseptisch overgebracht naar afzonderlijke agarhellingen van voedingsstoffen en toegestaan daar te groeien. De geïsoleerde soorten bacteriën, apart gekweekt op agar-slants, worden 'zuivere culturen' genoemd. In elke 15 tot 30 dagen worden ze overgezet naar verse scheuten, zodat ze hun oorspronkelijke kenmerken niet verliezen als gevolg van overbezetting, gebrek aan voedingsstoffen en accumulatie van metabolieten.

Op deze manier worden zuivere culturen van bacteriën in het laboratorium gehandhaafd door herhaaldelijk over te dragen naar verse scheuten met regelmatige tussenpozen. Dit proces staat bekend als 'behoud van pure cultuur'. Pure culturen worden in het laboratorium gehandhaafd voor hun latere identificatie door verschillende kleuring, biochemische, serologische en moleculaire technieken evenals voor hun toekomstig gebruik.

'Stock cultures' zijn standaard zuivere culturen, waarvan de identificatie internationaal is vastgesteld op genus-, soort-, ondersoort-, type- of subtypeniveau. Ze worden onderhouden in internationaal erkende microbiologische laboratoria.

Andere laboratoria kunnen ze uit deze laboratoria verkrijgen en in hun eigen laboratoria als hun voorraadkweek onderhouden, door herhaaldelijk over te stappen naar verse scheuten met regelmatige tussenpozen. Ze worden gebruikt voor de bevestigde identificatie van zuivere culturen verkregen in deze laboratoria door hun eigenschappen te vergelijken met die van de standaard stamkweken.

Beginsel:

De gemengde populatie van bacteriën die aanwezig zijn in een gegeven materiaal (vaste stof, vloeistof of oppervlak) wordt gekweekt op voedingsagarplaten met behulp van een spreidplaat of streakplaatmethode zoals eerder beschreven onder 'Teelt van bacteriën'. Elke geïsoleerde kolonie op een agarplaat bestaat uit één soort bacterie, omdat elke kolonie groeit uit een enkele bacterie.

Aldus worden bacteriën op agarplaten geïsoleerd door twee technieken als volgt:

(a) Spreidplaattechniek

(b) Streak plate-techniek

Representatieve kolonies (kolonies met ongelijke kenmerken) worden geselecteerd en aseptisch geïnoculeerd om agar-scheuten te scheiden om de zuivere kweken te verkrijgen. Na elke 15 tot 30 dagen worden ze overgezet naar verse scheuten voor het onderhoud van deze zuivere culturen.

Vereiste materialen:

Reageerbuisjes (5 nrs.), 250 ml erlenmeyer (1 nee), 0, 1 N NaOH, 0, 1 N HCI, gedestilleerd water, voedingsagar, niet-absorberend katoen, lus, knutselpapier, draad (of rubberen band), pH-papier (of pH-meter), bunsenbrander, autoclaaf, laminaire stromingskamer, incubator, platen die geïsoleerde kolonies bacteriën bevatten (spreidplaat of streepplaat).

Procedure:

1. De ingrediënten van voedingsagarmedium of het kant-en-klare poeder ervan dat voor 100 ml medium is vereist, worden gewogen en opgelost in 100 ml gedestilleerd water in een erlenmeyer van 250 ml door schudden en wervelen (figuur 6.4).

2. De pH wordt bepaald met behulp van een pH-papier of pH-meter en bijgesteld tot 7, 0 met 0, 1 N HC1 als het meer is of met 0, 1 N NaOH als dit minder is.

3. De kolf wordt verwarmd om de agar volledig in het medium op te lossen.

4. Voordat het stolt, wordt het medium in warme gesmolten toestand verdeeld in 5 reageerbuizen (elk ongeveer 20 ml).

5. De reageerbuisjes zijn van katoenstof voorzien, afgedekt met kraftpapier en met draad of rubberen band verbonden.

6. Ze worden gedurende 15 minuten bij 121 ° C (15 psi druk) gesteriliseerd in een autoclaaf.

7. Na sterilisatie worden ze uit de autoclaaf verwijderd en in een schuine positie gehouden om het medium af te koelen en te stollen. Deze reageerbuizen met gestold voedingsagarmedium in schuine toestand worden 'schimmels met voedingsagar' genoemd.

8. De stappen 10 en 11 moeten worden uitgevoerd volgens een aseptische techniek, bij voorkeur in een laminaire stromingskamer. De monding van de containers met gesteriliseerde media of culturen moet na het verwijderen van de katoenen plug boven de vlam van de bunsenbrander worden weergegeven en voordat deze terug wordt geplaatst.

Lussen moeten vóór gebruik worden gesteriliseerd boven vlam door ze te verhitten tot roodgloeiend en daarna 30 seconden afkoelen tot kamertemperatuur. Ze mogen nooit worden gebruikt als ze erg heet zijn, omdat ze de microben doden wanneer ze worden aangeraakt.

9. In het vorige experiment, als geïsoleerde kolonies konden worden waargenomen op de gespreide plaat of de strepenplaat, werden vijf kolonies met ongelijke kenmerken geselecteerd als representatieve kolonies.

10. Een lus wordt over vlam gesteriliseerd en een lus van bacteriën uit elk van de representatieve koloniën wordt aseptisch genomen. De lus wordt geïntroduceerd in de agarhoek, zodat de lus van bacteriën naar het einde van de helling gaat. De lus wordt op een golvende manier naar buiten verplaatst en raakt het oppervlak van de helling, zodat een golvende lijn wordt gevormd.

11. De lus wordt met behulp van een vlam gesteriliseerd en op dezelfde manier worden de rest van de vier representatieve kolonies afzonderlijk over vier schuine delen afzonderlijk in de linkerzijde geïnoculeerd. De lus wordt gesteriliseerd na elke inoculatie.

12. De vijf geïnoculeerde hellingen worden 24 uur geïncubeerd bij 37 ° C in een incubator.

Observaties (culturele kenmerken):

(i) Een golvende lijn met groei langs de lengte waarneembaar:

Groei heeft plaatsgevonden.

De helling wordt als volgt waargenomen voor schuine kenmerken (Figuur 6.5).

1. Overvloed van groei:

De hoeveelheid groei wordt aangeduid als geen, gering, gemiddeld of groot.

2. Pigmentatie:

Chromogene micro-organismen kunnen intracellulaire pigmenten produceren die verantwoordelijk zijn voor de kleuring van het organisme zoals gezien in oppervlaktekolonies. Andere organismen produceren extracellulaire oplosbare pigmenten die worden uitgescheiden in het medium en produceren ook een kleur. De meeste organismen zijn echter niet-chromomeer en zullen wit tot grijs lijken.

3. Optische kenmerken:

Optische kenmerken kunnen worden beoordeeld op basis van de hoeveelheid licht die door de groei wordt doorgelaten.

Deze kenmerken worden beschreven als:

(een) Ondoorzichtig: geen lichttransmissie.

(B) Translucent: Gedeeltelijke lichttransmissie.

4. Vorm:

Het verschijnen van de enkele lijnstrook van groei op het agaroppervlak wordt als volgt aangeduid:

(een) Filiform: continue, draadachtige groei met vloeiende randen.

(B) Echinulate: continue, draadachtige groei met onregelmatige randen.

(D) Effuse: Dunne, groeiende groei.

(E) Arborescent: boomachtige groei.

(f) Rhizoid: wortelachtige groei.

(ii) Geen groei langs de lijn van inenting:

Defecte techniek van inoculatie, Inoculatie wordt herhaald C Bepaling van het aantal bacteriën.

C. Bepaling van de bacteriën:

De mate van bacteriële activiteit in een bepaald monster in een bepaald stel omstandigheden hangt voornamelijk af van het totale aantal bacteriën dat erin aanwezig is, ongeacht hun soort. Daarom is het vaak nodig om het totale aantal bacteriën in monsters van voedsel, water, bodem, lucht en weefsel te achterhalen tijdens hun microbiologische analyse.

Het schatten van het aantal bacteriën in een bepaald monster wordt 'telling van bacteriën' genoemd. Er zijn verschillende methoden voor het tellen van bacteriën zoals hieronder gegeven. Al deze methoden hebben bacteriën nodig om aanwezig te zijn in een homogene suspensie.

Dat is de reden waarom vloeibare monsters worden verondersteld homogene suspensies van bacteriën te zijn en direct worden gebruikt, terwijl vaste monsters worden gehomogeniseerd in steriele zoutoplossingen, om homogene suspensies van bacteriën te krijgen.

Niet vaak gebruikt:

(I) Directe methoden:

(a) Rechtstreeks microscopisch aantal

(b) Elektronische celteller

(II) Indirecte methoden:

(D) Turbidimetrische methode

(E) Membraanfiltertelling

Meest gebruikt:

(f) Seriële verdunningsagar-plateringswerkwijze of methode van totale plaattelling (TPC-methode)

(a) Directe microscopische telling:

Bij deze methode wordt het aantal bacteriën dat aanwezig is in een hoeveelheid van de homogene suspensie van bacteriën direct onder een microscoop geteld en wordt het totale aantal bacteriën in het monster wiskundig bepaald.

Het voordeel van deze methode is dat deze zeer snel is. De nadelen zijn dat zowel levende (levensvatbare) als dode cellen worden geteld en dat de methode niet gevoelig is voor populaties van minder dan één miljoen bacteriën per milliliter.

Tellen kan als volgt in twee methoden worden gedaan:

(i) Kamer Petroff-Hauser:

Het is een gespecialiseerde telkamer, waarin een portie van de homogene suspensie van bacteriën direct onder een microscoop wordt geteld.

(ii) Breeduitstrijkje:

Bacteriecellen worden direct geteld onder de microscoop met behulp van gekleurde uitstrijkjes beperkt tot een gebied van 1 mm2 op de schuif. Het wordt voornamelijk gebruikt voor de opsomming van bacteriën in melk.

(b) Elektronische celenteller:

Een elektronische celteller zoals 'Coulter counter' wordt gebruikt om direct het aantal bacteriecellen te tellen. Een homogene suspensie van bacteriëncellen bereid in een geleidende vloeistof laat men een minuutopening passeren, waarover een elektrische stroom vloeit.

De weerstand bij de opening wordt elektronisch geregistreerd. Wanneer een cel door de opening passeert en niet-geleider is, verhoogt deze de weerstand tijdelijk. Het aantal keren dat de weerstand kortstondig toeneemt, wordt elektronisch geregistreerd, wat het aantal bacteriën in de suspensie aangeeft.

Het voordeel van deze methode is dat deze extreem snel is. De nadelen zijn dat zowel levende (levensvatbare) als dode cellen worden geteld en het instrument geen onderscheid kan maken tussen bacteriecellen en inerte deeltjes.

(c) Chemische methoden:

Deze methoden schatten de hoeveelheid van die stoffen, voornamelijk chemicaliën, die toeneemt met de toename van de bacteriepopulatie.

De belangrijkste geschatte parameters zijn:

(i) Eiwitconcentratie

(ii) DNA-concentratie

(iii) Droog gewicht

(iv) Koolstofdioxide-productie

(v) Zuurstofopname

(vi) Melkzuurproductie

(d) Turbidimetrische methode:

Wanneer bacteriën worden gekweekt in vloeibare voedingsrijke media (bijv. Voedingsbodem), maakt hun overvloedige groei de media troebel, omdat de bacteriecellen er meestal in blijven hangen. De troebelheid neemt toe met een toename van het aantal cellen in de media. Naarmate de troebelheid toeneemt, neemt de 'absorptie' of 'optische dichtheid (OD)' van de media toe.

De OD van de suspensie van bacteriecellen in het medium wordt gemeten met behulp van een spectrofotometer bij 600 nm. Het aantal bacteriecellen in de suspensie wordt gevonden door de OD te vergelijken met een standaardkromme die is opgesteld door de OD-waarden voor verschillende bekende concentraties bacteriën uit te zetten. De methode is snel, maar beperkt tot bacteriesuspensies van meer dan 10 miljoen cellen.

(e) Membraanfiltertelling:

Deze methode wordt gebruikt wanneer het aantal bacteriën in een vloeibaar monster zeer gering is. Om de concentratie van bacteriën te verhogen, wordt eerst het vloeistofmonster aseptisch gefilterd door een gesteriliseerd membraanfilterapparaat met behulp van een steriel membraanfilter.

Het membraanfilter dat de ingesloten bacteriën bevat, wordt aseptisch overgebracht naar een steriele petrischaal die een absorberend kussen bevat verzadigd met een selectief differentieel vloeibaar medium. Het medium sijpelt op het oppervlak van het filter. Na incubatie wordt het aantal kolonies dat is gevormd op het filter geteld met behulp van een eenvoudige microscoop.