Agrobacterium gemedieerde genoverdracht in planten | Biotechnologie (met diagram)

Agrobacterium gemedieerde genoverdracht in planten!

Agrobacterium is een gramnegatieve pathogene bacterie die betrokken is bij het veroorzaken van de vorming van een kroongal in plantensoorten. De vorming van kroongal is te wijten aan de overdracht van een segment van oncogeen (kanker veroorzakend) DNA in de plantencel op gewonde plaatsen.

Dit DNA-segment (transfer-DNA of T-DNA) is aanwezig op groot plasmide, Tumor-inducerende (Ti) plasmiden in de bacterie genaamd. Het T-DNA (ongeveer 20 kb lang) wordt door recombinatie in het plantenchromosoom geïntegreerd. Een reeks virulentie (vir) genen zijn betrokken bij het aansturen van het infectieproces. Dus wanneer een plantwortel of een stengel gewond is, geeft het bepaalde reacties af.

In reactie op die signalen worden de vir-genen van A. tumefactions geactiveerd en richten een reeks van gebeurtenissen die nodig zijn voor de overdracht van het T-DNA van het Ti-plasmide naar het chromosoom van de plant. De functie van verschillende vir-genen omvat een kopie van T-DNA, gevolgd door het hechten van een product aan de gekopieerde T-DNA-streng om als een leider te fungeren, vervolgens eiwitten samen met de lengte van het T-DNA toe te voegen, mogelijk als een beschermend middel. mechanisme.

Deze openen uiteindelijk een kanaal in het bacteriële celmembraan, waardoor het T-DNA passeert. Het T-DNA komt vervolgens de plant binnen via de wond. Het is echter nog steeds niet duidelijk hoe het bacteriële DNA van het cytoplasma naar de kern van de plantencel beweegt, of hoe het T-DNA in de plantenchromosomen wordt geïntegreerd.

Om deze bacteriën als een vector te gebruiken wordt zijn T-DNA-gebied verwijderd behalve de grensregio's en de vir-genen. Het transgen wordt dan ingevoegd tussen de T-DNA-gebieden, waar het wordt overgebracht naar een plantencel en wordt geïntegreerd in het chromosoom van de plant (figuur 1). Het T-DNA wordt gekloneerd in Ti-plasmiden, die op maat worden geknipt en in E.coli worden gerepliceerd om verdere manipulatie te vergemakkelijken. Deze vectoren worden gemobiliseerd in Agrobacterium-gaststammen en worden gebruikt om de plantenweefsels te infecteren.

Deze geïnfecteerde plantenweefsels worden vervolgens gekweekt op media die specifieke chemicaliën bevatten, groeiregulatoren om de regeneratie van getransformeerde cellen te vergemakkelijken. De selectie van transformanten wordt uitgevoerd in aanwezigheid van een antibioticum dat in het kweekmedium aanwezig is. De getransformeerde planten worden uiteindelijk geanalyseerd op stabiele integratie en functionele analyse van het geïnsereerde gen.

Protoplast Fusion:

Cellen zonder de celwand worden protoplasten genoemd. Deze protoplasten kunnen direct DNA opnemen in de aanwezigheid van bepaalde chemicaliën (zoals polyethyleenglycol, PEG). Een hogere concentratie van PEG veroorzaakt permeabilisatie van plasmamembraan, hetgeen de opname van DNA in protoplasten mogelijk maakt. Zelfs elektrische signalen kunnen worden gebruikt om kleine gaten in het plasmamembraan te creëren door een elektrische stroom door te laten.

Dit staat bekend als elektroporatie. Deze kleine openingen helpen dan bij de opname van vreemd DNA door protoplasten. Dit wordt vervolgens gevolgd door celwandvorming en het initiëren van celdeling. De productie van transgene planten door directe genoverdracht aan protoplasten hangt echter af van een efficiënt systeem van protoplast tot plantregeneratie.

Gene-gun of Biolistic Gen Transfer:

Dit is de meest recente techniek waarbij men DNA van interesse in een cel kan afleveren door microdeeltjes (zoals goud of wolfraam) met hoge snelheid te laden. Dit proces van het afleveren van DNA wordt bombardement genoemd. In de cel worden DNA-moleculen vrijgemaakt uit de deeltjes en uiteindelijk wordt dit DNA geïntegreerd in het nucleaire of organelegenoom van de gastheercel.

De weefselexplanten worden uiteindelijk gekweekt op media die specifieke hormonen / antibiotica bevatten om de getransformeerde planten te selecteren. Zodra het gen van belang is overgebracht naar de gewenste gastheer, moet de stabiele integratie ervan worden vastgesteld, die wordt uitgevoerd door planten te regenereren. Dit wordt bereikt door de weefselkweektechniek.

Het proces van weefselkweek kan grofweg worden verdeeld in vier fasen:

Fase I:

Omvat de selectie van de geschikte explantaten en de overdracht ervan naar voedingsmedium.

Fase II:

Omvat proliferatie van groeiend weefsel op het vermenigvuldigingsmedium.

Fase III:

Inclusief overdracht van groeiend weefsel (callus) naar media waar het zich kan onderscheiden in de verschillende delen.

Stage IV:

Inclusief overdracht van plantjes naar de natuurlijke omgeving. Er kunnen echter interessante genen op twee manieren worden toegevoegd als sense- en antisense-oriëntatie. Om het gen tot expressie te brengen of uit te drukken kan men het gen in zinsoriëntatie plaatsen. Als men echter het ongewenste product of een stap in een biochemische route wil blokkeren, kan men het gen in een antisense-oriëntatie plaatsen.